青蒿素对急性胰腺炎腺泡细胞炎症、迁移、侵袭和上皮间质转化的作用机制研究

寨 旭，裴红红，刘 俊，丁新爱

（西安交通大学第二附属医院急诊科，西安 710006）

蛋白酪氨酸激酶2/信号转导与激活因子3（JAK2/STAT3）通路是常见的调节细胞炎症、侵袭和上皮间质转化（EMT）的通路[1]。研究[2]证实，JAK2/STAT3通路的失活能够减轻重症急性胰腺炎大鼠的炎症反应；而青蒿素抑制JAK2/STAT3通路激活促进肝癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[3]。因此，推测青蒿素通过JAK2/STAT3通路可改善急性胰腺炎损伤。本研究以雨蛙素诱导的AR42J细胞为研究对象，分析AR42J细胞的炎症反应、迁移、侵袭能力和EMT标志物的水平，为急性胰腺炎治疗提供新的理论方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 鼠胰腺炎腺泡（AR42J）细胞购自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。

1.1.2 药品与试剂 青蒿素、雨蛙素、JAK2/STAT3通路抑制剂AG490和激动剂colivelin（上海源叶公司）；胎牛血清（FBS）、F12-K培养基（美国Gibco公司）；Transwell小室（美国Corning）；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（杭州主诺生物技术有限公司）；细胞计数试剂盒（CCK-8）[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]；青-链霉素混合液、0.1%结晶紫水溶液、基质胶、4%甲醇（北京索莱宝科技有限公司）；胰酶细胞消化液、RIPA裂解液、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、脱脂奶粉（上海碧云天生物技术有限公司）；鼠源[JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、E-钙粘蛋白（E-cadherin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纤连蛋白（FN）及β-actin一抗]、HP标记的山羊抗鼠IgG（二抗）（武汉三鹰公司）。

1.1.3 仪器 H4-20kr型低温高速离心机24孔板转子（湖南可成仪器设备有限公司）；DMI1 LED型倒置显微镜（德国Leica）；Multiskan FC型酶标仪（赛默飞世尔科技）；311X型二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技）；DYX-1A型低负压吸引器（上海宝佳医疗器械有限公司）；Mini-PROTEAN®Tetra小型垂直电泳仪（美国BIO-RAD）；OI1000型凝胶成像系统（广州广仪仪器有限公司）；SK-L330-Pro型摇床[大龙兴创实验仪器（北京）股份公司]等。

1.2 实验方法

1.2.1 AR42J细胞培养 将冻存的AR42J细胞复苏，接种于含F12-K培养基（20% FBS和1%青-链霉素混合液）的培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱中培养，接种后第1天换液，此后每2～3 d进行培养液的更换，细胞传代在细胞贴壁数＞80%时进行，取AR42J（对数生长期）进行后续实验。

1.2.2 分组及给药 胰酶细胞消化液消化处于对数生长期的AR42J细胞，收集细胞消化混合液，1 000 rpm·min-1离心5 min，向细胞沉淀中加入适量培养基重悬细胞沉淀，接种于培养板或者培养皿中。

1.2.2.1 青蒿素实验浓度筛选 将AR42J细胞分为对照组、雨蛙素组和实验组，对照组细胞不做处理，雨蛙素组细胞用100.0 nmol·L-1的雨蛙素干预24 h[4]，实验组细胞先用100.0 nmol·L-1的雨蛙素干预24 h，再加入12.5 μmol·L-1、25.0 μmol·L-1、50.0 μmol·L-1和100.0 μmol·L-1青蒿素培养24 h和48 h，随后对细胞活力进行检测筛选出青蒿素的最佳作用浓度。

1.2.2.2 实验分组与干预 将细胞分为6组，分别为对照组（处理如上）、雨蛙素组（处理如上）、青蒿素组、AG490组、抑制剂组、激动剂组，青蒿素组是在雨蛙素组基础上加入50.0 μmol·L-1青蒿素，AG490组是在雨蛙素组基础上加入50.0 μmol·L-1AG490，抑制剂组是在青蒿素组基础上加入50.0 μmol·L-1AG490，激动剂组是在青蒿素组基础上加入50.0 µg·mL-1JAK2/STAT3信号通路激动剂colivelin，每组设置3个复孔，干预24 h。

1.2.3 CCK-8法检测细胞活力 细胞给药24 h后，向96孔板的各孔中加入10 μL CCK-8溶液，在37℃，5% CO2培养箱中孵育2 h，用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度（OD）值。细胞活力（%）=（雨蛙素组或实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.4 ELISA试剂盒检测炎症因子表达水平 细胞给药24 h后，收集细胞上清液，4 000 rpm·min-1离心20 min，离心后保留细胞上清液并按照ELISA试剂盒说明书操作以检测上清液中白细胞介素（IL）-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α的表达水平。

1.2.5 Transwell小室法检测细胞的迁移能力 细胞给药24 h后，收集细胞沉淀，用无血清培养基重悬细胞并制成浓度为每毫升5×105个的细胞悬液，取0.25 mL置于小室上方，在下室中加入0.5 mL完全培养基继续培养24 h。擦去上室细胞，对下室细胞进行4%多聚甲醛固定20 min、0.1%结晶紫染色10 min。干燥后，在光学显微镜下对下室表面染色阳性细胞进行观察并拍照（5个视野/小室）。Image-J图像分析软件对染色阳性细胞进行细胞计数。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞的侵袭能力 细胞给药24 h后，收集细胞沉淀，用无血清培养基重悬细胞沉淀并制备成浓度为每毫升5×105个的细胞悬液。将-20℃冰箱中的基质胶提前放入4℃冰箱中融化，按照2:1的比例用无血清培养基稀释基质胶并加入到24孔板上室中，基质胶凝固后向上室中加入200 μL细胞悬液，下室中加入600 μL含20% FBS的培养基，培养24 h。取出上室，弃上室中的培养基并将上室内细胞擦除，用4%甲醇在室温下进行固定30 min，0.1%结晶紫在室温下进行染色10 min，用显微镜进行观察并拍照（5个视野/小室）记录细胞侵袭情况。

1.2.7 蛋白免疫印迹（WB）法检测相关蛋白表达水平 细胞给药24 h后，用PBS清洗细胞，除去死去的细胞和培养液，随后向待提蛋白的孔中加入适量RIPA裂解液，并置于冰上裂解30 min，收集细胞裂解混合液，于4℃离心机上以12 000 r·min-1的转速离心15 min，收集上清液，100℃高温变性20 min。按照待检测蛋白分子量配置适宜浓度分离胶和5%浓缩胶，每孔20 μL/孔样品（30 μg蛋白）点样，凝胶电泳后转膜，随后5%脱脂奶粉进行封闭2 h，加入一抗（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FN及β-actin），4℃过夜孵育，洗涤后加入二抗，室温摇床孵育2 h后加入显影液，置凝胶成像系统中分析记录。蛋白相对表达量=目的蛋白/内参蛋白。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计分析，Image J 1.8.0计算迁移、侵袭细胞数和蛋白灰度值。多组间比较采用单因素方差分析；2组间比较，符合正态分布且方差齐时，采用Dunnett's t检验，不符合正态分布时，采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度青蒿素对雨蛙素诱导的AR42J细胞活力的影响

见图1。

图1 不同浓度青蒿素对雨蛙素诱导的AR42J细胞活力的影响

2.2 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化降低雨蛙素诱导的AR42J细胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌水平

ELISA法检测各组AR42J细胞上清液中IL-1β和TNF-α的表达水平，见图2。

图2 ELISA法测定各组细胞上清液中IL-1β和TNF-α的表达水平

2.3 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化降低雨蛙素诱导的AR42J细胞的迁移能力

Transwell小室法检测细胞的迁移能力，见图3。

图3 Transwell小室法检测各组细胞的迁移能力

2.4 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化降低雨蛙素诱导的AR42J细胞的侵袭能力

Transwell小室法检测细胞的侵袭能力，见图4。

图4 Transwell小室法检测各组细胞的侵袭能力

2.5 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化减弱雨蛙素诱导的AR42J细胞的EMT进程

WB法检测各组细胞中EMT相关蛋白表达水平，见图5。

图5 WB法检测各组细胞中EMT蛋白表达水平

2.6 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化

WB法检测各组细胞中JAK2/STAT3通路相关蛋白表达水平，见图6。

图6 WB法检测各组细胞中JAK2/STAT3通路蛋白表达水平

3 讨论

本研究发现，青蒿素显著提升雨蛙素诱导的AR42J细胞的细胞活力，且50.0 μmol·L-1青蒿素干预雨蛙素诱导的AR42J细胞24 h的作用效果最好，可用于后续实验。本研究发现青蒿素能够减少IL-1β和TNF-α的分泌，改善雨蛙素诱导AR42J细胞的炎症损伤。本研究检测了AR42J细胞中EMT标志物的表达，发现雨蛙素促进AR42J细胞中N-cadherin、Vimentin和FN的蛋白表达，抑制E-cadherin的蛋白水平，从而增强了AR42J细胞的迁移、侵袭能力和EMT进程；同时，也发现青蒿素抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞的迁移、侵袭和EMT进程。

XIA等[5]发现柠檬素抑制JAK2/STAT3通路激活改善急性胰腺炎小鼠的胰腺组织的病理表现和炎症反应。本研究检测了AR42J细胞中JAK2/STAT3通路关键蛋白的表达水平，发现雨蛙素促进AR42J细胞中JAK2和STAT3的磷酸化水平，激活JAK2/STAT3通路；同时，青蒿素逆转了雨蛙素对p-JAK2和p-STAT3的促进作用，提示青蒿素可能阻断JAK2/STAT3通路活化。随后，本次研究发现JAK2/STAT3通路抑制剂AG490能够减轻雨蛙素诱导的AR42J细胞的炎症反应，缓解细胞的迁移、侵袭和EMT进程，且AG490与青蒿素在雨蛙素刺激的AR42J细胞中发挥协同累加作用，而JAK2/STAT3信号通路激动剂colivelin则逆转了青蒿素对雨蛙素诱导的AR42J细胞的影响。以上结果显示青蒿素阻遏JAK2/STAT3通路活化抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞炎症反应、迁移、侵袭和EMT进程。