液质联用法测定鹭鸶咯丸中马兜铃酸类成分△

谭乐俊，于新兰，林林，于凤蕊，牛艳，林永强*，戴忠

1.山东省食品药品检验研究院 国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室/山东省中药标准创新与质量评价工程实验室/中药配方颗粒共性技术山东省工程研究中心，山东 济南 250101；

2.新疆维吾尔自治区药品检验研究院，新疆 乌鲁木齐 830002；

3.中国食品药品检定研究院，北京 100050

鹭鸶咯丸是由麻黄、苦杏仁、石膏、甘草、细辛、炒紫苏子、炒芥子、炒牛蒡子、瓜蒌皮、射干、青黛、蛤壳、天花粉、炙栀子和人工牛黄15 味中药组成的中药复方制剂，具有宣肺、化痰、止咳的功效，用于痰浊阻肺所致的顿咳、咳嗽，症见咳嗽阵作、痰鸣气促、咽干声哑；百日咳见上述证候者[1]。

鹭鸶咯丸处方中含有辛温解表药细辛，研究表明细辛中含有痕量的马兜铃酸类成分[2-7]。马兜铃酸类成分是一系列结构类似的硝基菲类化合物，包括马兜铃酸和马兜铃内酰胺2 种结构类型，天然存在于马兜铃属（Aristolochia）及细辛属（Asarum）等马兜铃科植物中。自1993 年马兜铃酸肾毒性报道以来，马兜铃酸安全性问题一直备受关注。目前，国内外已有大量研究证实，马兜铃酸具有肾毒性、致癌和致突变作用[8-12]。2008 年，国际癌症研究机构将马兜铃酸列为Ⅰ类致癌物，并于2012 年将含有马兜铃酸的植物列为Ⅰ类致癌物[13-15]。因此，我国也相继采取了一系列控制风险的措施，将细辛药用部位由全草修改为根和根茎，且《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版对细辛中马兜铃酸Ⅰ的限度（＜0.001%）做了规定[1]。

鉴于马兜铃酸类成分对人体的严重危害性，确定鹭鸶咯丸中是否含有毒性成分马兜铃酸Ⅰ等马兜铃酸类成分，进一步加强鹭鸶咯丸的风险评估至关重要。本研究建立了基于多反应监测（MRM）的液质联用检测方法，同时快速筛查鹭鸶咯丸中是否含有马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅶa、马兜铃内酰胺Ⅰ和马兜铃内酰胺BⅡ 7 个马兜铃酸类成分，并快速准确测定马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ 3个成分的含量，为其安全性研究提供参考，也为其他含细辛中成药中马兜铃酸类成分的检测提供技术参考。

1 材料

1.1 仪器

LCMS-8050型三重四级杆液相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）；CP225D 型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW100 型高速粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）

1.2 试药

对照品马兜铃酸Ⅰ（中国食品药品检定研究院，批号：110746-201912，纯度：99.1%）；马兜铃酸Ⅱ（批号：P13J10F90613，纯度：99.4%）、马兜铃酸Ⅶa（批 号：Z02S11S123212，纯度：99.2%）、马兜铃内酰胺Ⅰ（批号：P27N10S104067，纯度：98.4%）均购自上海源叶生物科技有限公司；马兜铃酸Ⅲa（批号：ZZS-20-190-A6，纯度：99.73%）、马兜铃酸Ⅳa（批号：ZZS-20-602-A6，纯度：98.15%）、马兜铃内酰胺BⅡ（批号：ZZS-20-190-A6，纯度：97.0%）均购自上海甄准生物科技有限公司；甲醇、甲酸、甲酸铵均为色谱纯。

鹭鸶咯丸共15 批，涉及2 家生产企业（A、B）的15批样品（编号分别为A001～A013，B001、B002）。

2 方法与结果

2.1 超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS）分析条件

2.1.1 色谱条件 采用岛津Shim-pack Velox C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 µm），以甲醇（A）-0.1% 甲酸溶液（含5mmol·L-1甲酸铵，B）为流动相梯度洗脱（0～5 min，36%～50%A；5～11 min，50%～70%A；11～13 min，70%A）；流速为0.3 mL·min-1；进样量为2 μL。

2.1.2 质谱条件 采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI+），进行MRM；接口温度：300 ℃；脱溶剂温度：520 ℃；加热气流量：10 L·min-1。7 个马兜铃酸类成分的质谱参数见表1。

表1 鹭鸶咯丸中7个马兜铃酸类成分的监测离子对及碰撞电压

2.2 溶液的制备

2.2.1 7 个成分混合对照品溶液的制备 分别精密称取马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅶa、马兜铃内酰胺Ⅰ和马兜铃内酰胺BⅡ对照品适量，加70%甲醇制成质量浓度为20 ng·mL-1的混合溶液，即得。

2.2.2 对照品储备液的制备 精密称取对照品马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ9.33、19.90、18.24 mg，分别置100、500、250 mL 量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到相应的对照品储备液，质量浓度分别为91.58、39.44、71.79 μg·mL-1。

2.2.3 3 个成分混合对照品溶液的制备 分别精密量取马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ对照品储备液20、5、10 μL，置10 mL 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备 取本品15 g，加硅藻土7.5 g，研细，混匀，取6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.5 阴性样品溶液的制备 取处方中除去细辛的其他药味，按处方比例制成缺细辛阴性样品，按2.2.4项下方法制得缺细辛阴性样品溶液。

2.3 马兜铃酸类成分的筛查

分别精密吸取7 个成分混合对照品溶液与15 批供试品溶液各2 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，按2.1 项下条件进行测定。结果收集到的15 批鹭鸶咯丸中未检出马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅶa 和马兜铃内酰胺BⅡ，检出马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ（图1）。

图1 混合对照品和鹭鸶咯丸MRM色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 分别精密吸取2.2 项下的混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各2 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，进行测定。结果供试品色谱中，在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而阴性样品色谱中无相应色谱峰。说明处方中其他药味对测定结果无干扰（图2）。

图2 鹭鸶咯丸专属性MRM色谱图

2.4.2 线性关系考察 分别精密量取2.2 项下的马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ对照品储备液20、10、20 μL，置10 mL 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到对照品浓溶液；分别精密量取对照品浓溶液10、20、50、100、200、500、1000 μL，置1 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到3 个成分的系列质量浓度对照品溶液。分别精密吸取上述系列质量浓度对照品溶液各2 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定峰面积积分值。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归，回归方程分别为马兜铃酸Ⅳa：Y=14 022X+6771（r=1.000 0），进样量为1.83～183.15 pg 时与峰面积线性关系良好；马兜铃酸Ⅰ：Y=28 875X-2158（r=0.999 9），进样量为0.39～39.44 pg时与峰面积线性关系良好；马兜铃内酰胺Ⅰ：Y=2882X-803（r=0.999 9），进样量为1.44～143.59 pg时与峰面积线性关系良好。

2.4.3 检测限（LOD）和定量限（LOQ）当马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ质量浓度分别为0.18、0.20、0.72 ng·mL-1时，3 个成分的信噪比（S/N）约为3，计算出3 个成分的LOD 分别为1、1、4 ng·g-1。

当马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ质量浓度分别为0.46、0.39、2.86 ng·mL-1时，3个成分的S/N 约为10，计算出3 个成分的LOQ 分别为3、2、18 ng·g-1。

2.4.4 基质效应考察 分别精密量取2.2 项下马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ对照品储备液20、5、10 μL，置10 mL 量瓶中，加阴性样品溶液稀释至刻度，摇匀，即得到阴性加标溶液。

分别精密吸取2.2 项下混合对照品溶液和以上阴性加标溶液各2 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，按2.1项下条件进行测定。综合3个待测成分的检测结果，溶剂加标响应与基质加标响应的比值（基质效应）均为90%～110%，表明基质基本无影响，可以采用溶剂配制对照品溶液用于检测。

2.4.5 精密度试验 精密吸取2.2 项下的马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ混合对照品溶液2 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，连续进样6次，测其峰面积积分值，马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ峰面积的RSD 分别为1.02%、1.67%、1.66%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 重复性试验 按照2.2.4项下方法，平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取2 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定。马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ含量的RSD分别为0.68%、0.01%、1.04%。表明该方法的重复性良好。

2.4.7 加样回收率试验 精密称取已测知马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ含量的鹭鸶咯丸样品（A012）15 g，加硅藻土7.5 g，研细，混匀，取3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入等量的马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ对照品溶液，按2.2.4项下方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取2 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定。结果马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ的平均回收率分别为99.4%（RSD 为1.27%）、96.1%（RSD为1.63%）、96.4%（RSD为2.98%），表明该测定方法的准确性良好（表2）。

表2 马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ的加样回收率试验结果

2.4.8 稳定性试验 取2.4.6 项下同一份供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、25 h 测定3 个成分的峰面积积分值，结果马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ峰面积的RSD 分别为1.46%、2.43%、2.23%，表明供试品溶液在25 h内稳定性良好。

2.5 样品测定

15 批鹭鸶咯丸样品分别按2.2.4 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下条件进样测定，结果A 厂家样品均检出马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ，B 厂家样品未检出马兜铃酸Ⅰ。马兜铃酸Ⅳa 质量分数为0.17～0.26 µg·g-1（A001～A013、B001、B002）、马兜铃酸Ⅰ质量分数为0～0.01 µg·g-1（A001～A013）、马兜铃内酰胺Ⅰ质量分数为0.04～0.13 µg·g-1（A001～A013、B001、B002），见表3。

表3 鹭鸶咯丸中3个马兜铃酸类成分质量分数测定结果（n=15）μg·g-1

3 讨论

3.1 检测方法的选择

鹭鸶咯丸由15 味中药粉末加炼蜜制成，成分复杂多样，另细辛中马兜铃酸类成分的含量较低[3,6]，且细辛处方量仅占比1.1%，进而选择灵敏度高、专属性强、基于MRM 模式的液质联用技术进行同时检测与分析。

3.2 分析条件的优化

筛选的7 个马兜铃酸类成分中马兜铃酸Ⅶa 与马兜铃酸Ⅳa为同分异构体，两者色谱保留行为基本一致，质谱参数优化后定量离子相近，为实现两者的准确测定，先后分别以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸铵）为流动相，发现流动相组成对组分的峰形、分离度和灵敏度均有影响。以甲醇-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸铵）为流动相梯度洗脱时待测组分可避免相互干扰，峰形和灵敏度更好，故选择该色谱条件。

3.3 制备方法考察

为保证马兜铃酸类成分能被提取完全，以检出的马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ3 个马兜铃酸类成分为指标，对供试品溶液的制备方法进行考察，包括样品的均匀化程度（样品与硅藻土比例1∶0、1∶0.5、1∶1）、不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇）、不同提取方式和时间（超声15、30、60 min，回流30、60 min）。结果采用样品与硅藻土比例1∶0.5，研细，加入70%甲醇超声处理30 min的方法能简便且快速的将鹭鸶咯丸中马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ3 个马兜铃酸类成分提取完全。

3.4 色谱柱耐用性的考察

本研究在相同的色谱条件下，考察了Thermo Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 µm）Shim-pack Velox C18（100 mm×2.1 mm，2.7 µm）和Shiseido CAPCELL CORE C18（100 mm×2.1 mm，2.7 µm）3 个不同品牌色谱柱，结果表明，不同品牌色谱柱对马兜铃酸Ⅳa、马兜铃酸Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅰ3个成分的检测基本无影响，适用范围广。

3.5 样品结果分析

通过初步筛查和表3结果可知，15批样品均未检出马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅶa和马兜铃内酰胺BⅡ，检出马兜铃酸Ⅰ（0～0.01 µg·g-1）、马兜铃酸Ⅳa（0.17～0.26 µg·g-1）和马兜铃内酰胺Ⅰ（0.04～0.13 µg·g-1）。在已发现的马兜铃酸类成分中，因取代基不同使其作用靶标不同，从而毒性差异较大，较明确有肾毒性和潜在致癌性的主要为马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ，马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ均未表现明显毒性[15-16]。按《中国药典》2020 年版（一部）细辛药材中含马兜铃酸Ⅰ的含量限度（0.001%）计算，鹭鸶咯丸中折合马兜铃酸Ⅰ限度为0.055 µg·g-1，全部样品均在安全范围内。由于细辛中马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ的安全风险指数不明确，对其安全性认识局限，无限量标准[16]，故暂不制定鹭鸶咯丸中马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ的限度，后续会对鹭鸶咯丸中这2 个指标成分的安全性做进一步研究。

4 结语

本研究采用基于MRM 的液质联用技术对鹭鸶咯丸中痕量马兜铃酸类成分进行了筛查与分析，建立的方法准确、灵敏、可靠，可为鹭鸶咯丸的安全性研究提供基础数据，也可为本品及其他含细辛中成药品种的相关研究提供参考。