CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在微藻中的应用

刘丽娴, 郭 栗, 杨官品

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在微藻中的应用

刘丽娴, 郭 栗, 杨官品

(中国海洋大学 海洋生命学院, 山东 青岛 266003)

微藻是单细胞光合原生生物的统称。微藻富含高价值的产物, 如蛋白质、DHA、虾青素等, 广泛用于食品、保健品、化妆品和饲料生产。基因编辑技术是微藻遗传学研究和遗传改良的新工具。目前, 广泛使用的基因编辑技术有锌指蛋白-核酸酶系统(zinc-finger nucleases system, ZFN)、转录激活样效应蛋白-核酸酶系统(transcription activator-like effector nucleases system, TALEN)和成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR合作蛋白系统[clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas) system], 简称CRISPR/Cas系统。ZFN和TALEN融合了DNA特定序列识别蛋白和核酸内切酶, 需要根据拟识别DNA序列修改识别蛋白氨基酸序列, 过程繁琐, 效率低, 而CRISPR/Cas系统操作简便, 只需设计拟识别DNA序列小引导RNA即可, 编辑效率高, 可同步编辑多个基因。目前, 已有编辑干扰、编辑激活、编辑敲除、编辑插入等衍生系统, 还有引导编辑、碱基编辑等, 也可以编辑RNA分子。CRISPR/Cas在微藻中应用广泛。本文综述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在微藻中的应用现状。

微藻; 基因编辑; CRISPR/Cas9系统

成簇规则间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)于1987年在大肠杆菌中首次被发现[1-4]。之后陆续在许多细菌中也发现了CRISPR序列, 并逐渐阐明了其生物学意义。CRISPR/Cas系统广泛用于动植物遗传育种, 微生物工程, 合成生物学等研究, 并在不断改进, 以满足多样化的研究和应用需求。近年来, CRISPR/Cas9系统在微藻中的应用越来越多。本文简要介绍了CRISPR/Cas系统, 重点综述了CRISPR/ Cas9系统在微藻中的应用, 以期为微藻的相关研究提供参考。

1 CRISPR/Cas系统

成簇规则间隔短回文重复序列由前导、重复和间隔序列构成。前导序列长20～534 bp, 腺嘌呤和胸腺嘧啶含量高, 是CRISPR的启动子[5-6]。重复序列长21～48 bp, 其转录本可形成发夹结构[7-8]。间隔序列各异, 长26～72 bp, 是免疫外源DNA的效应序列。病毒或外源DNA的部分序列可插入到CRISPR引导序列端, 形成新的间隔序列。当相应的病毒或外源DNA再次入侵时, CRISPR便会发挥免疫作用[5, 7, 9-11]。

CRISPR合作蛋白Cas的编码基因位于CRISPR基因附近[5]。CRISPR和Cas协同发挥作用, 使细菌免疫有特定间隔序列的病毒或外源DNA的效应序列, 防止入侵。CRISPR/Cas系统介导的免疫过程分为适应、表达和干扰3步, 参与的蛋白各异。表1列出适应过程Cas1和Cas2将入侵的DNA片段整合到CRISPR基因座中, 进入表达步骤, CRISPR被转录成前体crRNA (pre-crRNA), 前体crRNA结合到Cas蛋白上并经RNase切割, 最终形成成熟的crRNA (CRISPR RNA)。当外源DNA再次侵入时, 干扰步骤发挥作用, crRNA与外源DNA互补, Cas蛋白行使核酸酶功能切割外源DNA[1, 12-14], 实现免疫。CRISPR/ Cas系统存在于约一半已测序细菌基因组和几乎所有的古细菌基因组中。但在真核生物和病毒中却不存在[5, 8, 11, 15-16]。

表1 CRISPR/Cas系统分类及其特征[17-18]

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术

Sapranauskas等[19]证明嗜热链球菌CRISPR/Cas系统可转移到大肠杆菌中发挥免疫作用, 保护转化的质粒和转染的噬菌体。2012年, 双RNA分子被发现可引导Cas9切割细菌基因组任意位置[20], Cas9的可操纵性和编辑功能在许多生物中通用, 仅需改变与靶DNA互补结合的引导RNA分子。这种高效、通用的系统迅速获得许多研究者的青睐, 他们也因此获得2020年诺贝尔化学奖。这一划时代的发现推动了各种生物的基因编辑进程。

常用的CRISPR/Cas9基因编辑技术属于Ⅱ型CRISPR/Cas系统。参与CRISPR/Cas作用的各组分如下: (1) crRNA。crRNA5′端的20个核苷酸各不相同, 结合不同的靶DNA。该部分由外源的DNA序列插入CRISPR序列的间隔区, 先转录形成pre-crRNA, 再切割成crRNA[12, 21]。(2) tracrRNA(-activating crRNA)。tracrRNA通过RNase Ⅲ触发pre-crRNA加工, 随后通过Cas9激活crRNA引导的靶DNA切割[20-21](图1a)。(3) sgRNA(single guide RNA)。crRNA和tracrRNA连接, 形成长约100 bp的单分子引导RNA[22], GC含量约40%～60%[23](图1b)。(4) Cas9蛋白。Cas9蛋白是2个RNA引导的DNA核酸内切酶。Cas9有2个结构域。HNH结构域切割与crRNA互补的DNA链, RuvC结构域切割非互补DNA链[20]。Cas9识别crRNA互补的20 bp DNA序列和三核苷酸[12]。(5) PAM(protospacer-adjacent motif)序列。PAM序列与目的基因常为NGG, 是Cas9核酸酶特异性识别位点。PAM序列对间隔区的选择有CRISPR类型特异性[24]。质粒DNA会在PAM序列上游3个碱基对的位置切割并产生平末端。而短线型双链DNA, 与crRNA序列互补的目的基因DNA链在PAM序列上游3个碱基对的位置被切割, 非互补DNA链在PAM上游的3～8个碱基对内的1个或多个位点被切割。非互补DNA链首先被核酸内切酶切割, 随后被3′-5′端的外切核酸酶切割[20]。PAM序列在平均每 16 个碱基中出现1次, 限制了可以建立的目标数量[25]。

图1 CRISPR/Cas9系统切割原理

3 微藻中CRISPR/Cas9系统的应用

2014年, CRISPR/Cas9技术首次在微藻中成功应用。Jiang等[26]将sgRNA和Cas9基因转入莱茵衣藻, 证明Cas9和sgRNA在莱茵衣藻中能正常发挥作用, 介导靶向基因修饰。表达CRISPR/Cas9系统的构建物转化进藻细胞后, sgRNA与目标DNA结合, 引导Cas9切割DNA, 产生双链DNA断裂(double strand break, DSB)。DSB经过非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源重组修复(homologous recombination, HR), 引入插入或缺失, 敲除基因(基因失活)。若外源DNA和表达CRISPR/Cas构建物同时转化, 则可插入编辑的基因[27]。可根据不同目的设计特定的sgRNA, 获得编辑藻株或转化藻株。Cas9和sgRNA也可以纯化后融合成复合物, 转化进细胞, 实现编辑。

实现CRISPR/Cas9基因编辑的微藻越来越多。表2根据Cas9的表达位置, 可以将微藻CRISPR/Cas9基因编辑的方式可以分为3类: (1) Cas9基因整合到微藻基因组中发挥功能, 常用细菌质粒为构建物进行转化。(2) Cas9以游离蛋白方式在微藻基因组中发挥功能, 通常是先形成核糖核蛋白复合体(Cas9-gRNA ribonucleoprotein)再导入微藻细胞。(3) 构建游离的附加体(episome)转入微藻细胞。附加体上Cas9和gRNA表达后发挥功能, 但附加体不整合进基因组, 去除抗生素选择压后, 附加体因生物稀释而消失, 如图2所示。

注: A, 以细菌质粒为扩增方法构建Cas9基因和gRNA表达构建物, 整合进微藻基因组, 组成型表达; B, 合成和纯化Cas9和gRNA, 形成核糖核蛋白复合物, 瞬时发挥功能; C, 以episome为载体构建Cas9和gRNA表达构建物转入微藻, 但不整合进基因组, 基因表达后瞬时发挥作用, 去除抗生素选择压, 附加体因生物稀释而消失。

3.1 CRISPR/Cas9系统基因组整合-细菌质粒载体构建物转化

细菌质粒是常用的表达Cas9-gRNA基因的构建物。质粒是细菌体系, 构建方便, 分子量小, 在植物、动物等的基因工程研究中使用广泛。在微藻中应用CRISPR/Cas系统, 要用细菌质粒为框架, 构建Cas9-gRNA基因表达构建物, 把Cas9基因和sgRNA单元表达元件集中在同一质粒或不同质粒上, 用合适的转化方法, 将细菌质粒构建物(重组质粒)转入微藻细胞并整合在微藻基因组DNA中, 实现Cas9蛋白基因和sgRNA的组成型表达(图2A)。

2014年, Jiang等[26]构建CRISPR/Cas9细菌质粒构建物, 实现莱茵衣藻内源基因靶向敲除。这是CRISPR/Cas9技术在微藻中的首次应用。虽然获得了突变体, 但是莱茵衣藻的编辑效率并不很高。为了提高莱茵衣藻的编辑效率, 2017年, 该研究团队又将sgRNA表达组件插入Cas9基因的内含子中, 实现两个成员共享一套表达控制元件, 使莱茵衣藻的编辑效率提高50倍[28]。

在微藻中, CRISPR/Cas9技术是新兴的技术, 需要通过对已知基因的编辑, 证明其可行性。Lin等[29]首次在小球藻中实现CRISPR/Cas9技术应用, 他们把表达Cas9和sgRNA的细菌质粒构建物转化进小球藻(), 敲除其3(omega-3 fatty acid desaturase, ω-3脂肪酸去饱和酶)基因, 突变株与野生型相比, 染色后脂质积累荧光增加了67%。Ortega- Escalante等[30]将表达sgRNA和Cas9基因的细菌质粒构建物首次转入团藻()细胞, 获得了发育基因(gonidialess A, 无性腺A)基因缺陷突变株, 验证了CRISPR/Cas9技术在团藻基因编辑中的可行性。三角褐指藻()是硅藻的研究模式藻。Nymark等[31]构建含CRISPR/Cas9系统的细菌质粒构建物并转化进三角褐指藻, 是CRISPR/ Cas9在硅藻中的首次尝试, 获得(chloroplast signal recognition particle 54, 叶绿体信号识别因子54)基因缺陷的突变藻株, 突变体对强光敏感。

CRISPR/Cas9技术编辑微藻已知基因成功后, 就可以用来研究微藻未知基因功能功能, 获得有益突变株。Vogler等[32]将编码Cas9-GFP融合蛋白基因的细菌质粒构建物转入微拟球藻()细胞, 获得了β-葡萄糖合成酶和糖基化酶基因缺陷的突变株, 突变株中不溶于甲醇的水溶性碳水化合物积累减少但无生长缺陷, β-葡聚糖合酶基因的敲除可导致细胞自发荧光显著变化。Slattery等[33]和Hopes等[34]分别利用CRISPR/Cas技术靶向敲除三角褐指藻和假微型海链藻的urease(脲酶)基因, 突变株无法利用尿素作为生长的氮源, 藻细胞生长量降低, 藻细胞尺寸减小。

另外, 因Cas9组成型表达对某些藻类, 如莱茵衣藻, 有毒性。因此, 诱导型启动子的应用可解决Cas9的毒性问题[26, 35]。

3.2 Cas9蛋白基因和sgRNA瞬时表达

附加体(episome)类似质粒, 通常比细菌质粒大, 在微藻中有一定程度的自我复制能力, 是真核生物染色体外遗传结构。与细菌质粒构建物的最大区别是, episome不整合到基因组中。在微藻中转化含CRISPR/Cas9系统的episome构建物, 可发挥编辑作用但不整合到宿主基因组中, 在去除抗生素选择压后, 因生物稀释作用, 附加体随微藻繁殖而逐渐消失[36](图2C)。目前, 在微拟球藻和三角褐指藻中, 微藻附加体构建物均有应用。

Wang等[37]通过构建含有CRISPR/Cas9系统的附加体, 实现微拟球藻30号染色体中精确连续切除约10 kb的大片段。缺失大片段的突变株生长与野生型相比没有显著变化。因此, 用此方法可得到最小的微拟球藻功能基因组(底盘基因组)。Poliner等[38]构建有抗生素选择标记和有CRISPR系统的附加体构建物,CRISPR/Cas9系统可精确地在微拟球藻目标位置产生双链DNA断裂, 引入插入突变, 去除抗生素选择压力后, 消除附加体, 从而产生无标记的非转基因藻株。Moosburner等[39]将人工构建的episome(Cas9-ShBle: sgRNA)转化到含有Pta-MOB质粒的大肠杆菌中, 再通过细菌转染将episome转入三角褐指藻, 实现单基因和多基因敲除, 效率分别是48%和25%。

利用构建附加体方式进行CRISPR/Cas9基因编辑, 不整合到基因组中, 能产生定点突变并可以避免Cas9基因对藻细胞的长期毒害。但是, 构建附加体方式在微藻中应用不多, 大多都是在模式微藻中进行的。

3.3 核糖核蛋白复合体(Ribonucleoproteins, RNP)直接导入

RNP直接导入是将Cas9蛋白体外表达纯化并与sgRNA融合形成RNP复合物后, 将RNP共同导入细胞(图2B)。复合物的直接导入需充分考虑半衰期、转化效率等问题[40]。对于低等植物和单细胞生物, RNP直接导入成功率高。微藻是单细胞低等生物, RNP直接导入非常适合在微藻中使用。有研究表明, 莱茵衣藻转化Cas9基因表达靶向敲除低效率可能是载体驱动的Cas9基因长期在细胞内表达诱导的毒性造成的[41]。RNP直接转入瞬时表达, 可以避免Cas9基因表达相关的细胞毒性效应和脱靶效应。

2016年, Shin等[41]将Cas9蛋白和sgRNA复合体导入莱茵衣藻, 证明这种方法显著提高了CRISPR/ Cas9系统在衣藻中的诱变效率和特异性, 与转化含Cas9基因的质粒相比, 靶向突变效率提高了100倍, 能最大限度减少脱靶, 同时降低Cas9蛋白毒性。

同步敲除莱茵衣藻已知功能的(色氨酸合酶β亚基基因)、(叶绿体SRP43触角组装基因)和(叶绿素生物合成基因), 可建立基于5-氟吲哚和利用菌落颜色的筛选方法[41]。将RNP导入胶球藻(sp), 敲除了(叶绿体信号识别因子基因), 藻落呈淡绿色[42]。靶向敲除微绿藻()(硝酸还原酶基因)和(类胡萝卜素异构酶基因), 获得基因“功能丧失”敲除藻株[43], 突变株不能利用硝酸盐作为氮源。Serif等[44]鉴定并用RNP敲除了三角褐指藻2个内源性标记基因和光感受器转录因子, 实现了多基因同步敲除, 证明了RNP直接导入可实现硅藻的基因编辑; Kim等[45]选择同时使用质粒表达Cas9的方法和RNP方法转化小球藻, 分别敲除其和(腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因)。

进行科学研究的最终目的是要能够应用到实际生产中, RNP直接导入可编辑筛选高生产力藻株。Baek等[46]用RNP敲除莱茵衣藻(叶绿体信号识别因子基因), 光合效率大幅提升, 生产力提高。后又敲除(玉米黄质环氧化酶基因), 实现莱茵衣藻黄斑色素光合自养生产, 并用做蛋鸡饲料[47]。Shin等[48]用RNP敲除莱茵衣藻PLA2(磷脂酶A2)基因, 提高了莱茵衣藻脂质生产力。Chang等[49]用RNP编辑扁藻(sp.)AGP(ADP葡萄糖焦磷酸化酶)基因, 提高了脂质生产力。Hu等[40]用RNP编辑杜氏盐藻()β-胡萝卜素羟化基因, 使β-胡萝卜素含量比野生株提高2.2倍。Nomura等[50]用RNP编辑细小裸藻()(葡聚糖合酶基因), 实现单链寡核苷酸精准敲入, 使裸藻储存更少但更大的副淀粉颗粒。

RNP直接导入已成功应用于许多微藻的基因标记, 瞬时存在的Cas9蛋白, 不会对目标微藻产生长期毒害。这种方式也有局限性, RNP复合物的形成需要Cas9纯度较高, 但其获得较为困难。因此, 选择用细菌质粒为框架, 构建Cas9基因和gRNA单元表达构建物会更加简便。

续表

4 应用于微藻的其他CRISPR/Cas系统

与Cas9核酸酶有相同作用的Cas12a(Cpf1)也是被单RNA引导的酶。与Cas9识别PAM序列不同, Cpf1内切酶识别富含胸腺嘧啶的DNA序列, 如5′-TTTN-3′, 产生黏性双链断裂[51]。Cas12a(Cpf1)核酸内切酶在距PAM 18～23 bp的位置切开DNA, 引入DSB。因此, 非同源末端修复可能不影响Cas9需要的PAM和识别序列, Cas12a可再次切割同一位点[52]。用CRISPR/Cpf1系统的RNP复合物和单链寡核苷酸高效编辑莱茵衣藻(叶绿体信号识别因子基因)、(参与叶绿素捕光复合物的组装)和(磷酸盐转运蛋白基因) 3个基因, 获得淡绿色、小型化、生长慢的藻株[53]。Naduthodi等[52]纯化的Cas12a (FnCas12a)蛋白(Cpf1), 将crRNA与Cas12a组合成RNP复合物, 实现了海洋微拟球藻硝酸还原酶基因敲除。

除了Cpf1和Cas9外, 还有其他Cas9变体, 如Cas9n(Cas9 nickase)可以造成单链DNA的断裂, 类似限制性核酸酶功能, 产生一个切口, 减少脱靶效应的发生。

5 CRISPR/Cas9系统的验证

CRISPR/Cas9系统每一个元件都是基因编辑不可或缺的。表达Cas9的重组质粒常有整合失败的情况, Cas9基因成功表达需要验证。与Cas9基因共表达一个报告基因, 如、基因等, 通过荧光可初步确定Cas9 的成功表达[36, 38]。Jiang等[26]设计的Cas9基因表达构建物上有一个20 bp位点, 可被ApaL Ⅰ酶切消化。如果Cas9基因成功整合, PCR扩增产物不含这段序列, 因而抗ApaL Ⅰ消化。Wang等[54]对转化后的微藻基因组DNA进行巢式PCR扩增片段, 用限制酶Pvu Ⅱ处理。Pvu Ⅱ可将野生型PCR片段消化成2条带, 而突变型无限制酶位点, 抗限制酶消化。

编辑微藻肉眼或显微镜可辨表型的对应基因就是验证CRISPR/Cas9系统的直接方法。莱茵衣藻和基因分别编码叶绿体SRP43触角组装和Mg-原卟啉IXS-腺苷甲硫氨酸O-甲基转移酶编辑成功后获得肉眼可辨的浅绿色、黄色或棕色藻落[41]。常用的和分别编码硝酸还原酶和亚硝酸还原酶, 敲除后藻株无法利用硝酸盐或亚硝酸盐氮源, 肉眼上识别藻落呈黄色, 但能在含铵盐的f/2培养基中正常生长, 藻落呈正常绿色[45, 55]。

因此, 通过验证可辨表型的基因编辑方法, 在很大程度上减少了抗生素的使用, 不仅可以节省实验成本, 而且可以减少对环境的污染。

6 微藻中CRISPR介导的表达干扰(CRISPR-interference, CRISPRi)

CRISPRi仍用gRNA引导突变的Cas9(deficient Cas9, dCas9)识别和结合DNA, 干扰基因转录和基因表达[56]。dCas9的RuvC和HNH2个核酸酶结构域沉默突变, D10A和H840A, 失去内切酶活性, 但保留了DNA识别和结合活性, 与sgRNA共表达时可形成DNA识别复合体, 特异性干扰基因转录[20, 56-57]。CRISPRi可以同时干扰多个靶基因转录, 干扰作用可逆[56, 58]。CRISPRi在蓝细菌中较早运用。Gordon等[59]用CRISPRi实现了蓝藻中心碳代谢动态调节和通量操控。Huang等[60]用CRISPRi调控蓝藻基因表达, 增加了琥珀酸合成。成功应用CRISPRi的第一个真核微藻是三角褐指藻。Nymark等[31]构建含dCas9基因的质粒构建物, 转化三角褐指藻, 实现了(叶绿体信号识别因子基因)基因沉默, 突变藻株对强光敏感。Kao等[61]在莱茵衣藻中用CRISPRi干扰了(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)表达, 降低了叶绿素含量, 提高了脂质积累。Ajjawi等[62]用CRISPR/Cas9系统引入反向遗传学插入突变, 调控微拟球藻()基因表达, 在半连续生长条件下, 使脂质含量较野生型提高2倍, 但突变株生长缓慢。Stukenberg等[63]构建编码dCas9基因的细菌质粒构建物, 转化三角褐指藻, 沉默了(液泡转运伴侣复合体基因, vacuolar transport chaperone complex gene)和(假定存在的磷酸盐转运蛋白基因, putative phosphate transporter gene), 突变体在磷限制的条件下,基因表达上调10倍, 而基因表达下调2倍。

dCas9仍具有结合sgRNA的功能, 而不具备剪切功能。sgRNA结合至基因的转录起始位点会沉默基因功能, sgRNA结合至转录抑制物或活化物, 会激活或抑制基因的转录。因此, 可以根据需要设计不同的sgRNA实现研究目的。CRISPRi和CRISPRa(转录激活, CRISPR activation)均是可逆的, 不会对基因组DNA产生永久性的改变。

7 讨论和展望

在微藻中, 研究目标基因的功能, 在不影响其生长的情况下, 最优的方法是实现基因的完全敲除, 再进行表型或生化指标的后续验证。利用同源重组方法可以实现这种目的, 但是真核生物同源重组受非同源性末端修复抑制, 仅存在于细胞周期的特定阶段。我们可以通过干扰非同源末端修复的特异DNA连接酶, 或在细胞周期同源重组特定阶段进行转化, 来提高同源重组效率。在设计同源重组敲除基因过程中有RNP参与, 定点切割可提高转化效率[27]。有证据表明ZFN在莱茵衣藻中HDR(homology- directed repair)效率高于CRISPR/Cas9系统[64]。ZFN和Cas9定点敲除可实现目标微藻同源敲除验证微藻中绝大多数基因的功能, 将有益基因过表达, 可获得高生产力的藻株。同样, 组合使用Cas9和Cre重组酶, 在微拟球藻中已实现连续敲除内源基因和敲入新基因[35], 敲除生化过程中的酶基因, 可增加上游产物的积累。

在CRISPR/Cas9设计的过程中gRNA侧翼增加有核酶(ribozyme)HH和HDV, 可以更加精确切割[37], 用内源核定位信号(nuclear located signals, NLSs)替代哺乳动物NLSs提高Cas9靶向精度[54], 在设计sgRNA时提高特异性, 降低Cas蛋白与其它类似sgRNA分子结合, 避免非特异性切割[51], 选择GC含量低于70%的靶序列可降低脱靶效应[65]。模式微藻莱茵衣藻, 化脓性链球菌Cas9(Cas9)对其毒性较强, 而金黄色葡萄球菌Cas9(Cas9)毒性较弱, 因此更适合莱茵衣藻的基因编辑[30]。但是,Cas9的精确靶向度不如Cas9。最新鉴定出的Cas9-HF是Cas9的变体, 提高了Cas9的精确度, 应用于人体细胞, 将脱靶活性降低了大约90％[66], 而Cas9的变体MiCas9也显著提高单链寡核苷酸介导的精确编辑, 提高长片段基因插入效率, 减少缺失突变的产生[67]。在微藻中我们也可以利用这些高精确靶向的Cas9蛋白, 获得更高的编辑效率。

Cas9n(Cas9 nickase)与修饰单碱基酶连用构成CRISPR 碱基编辑系统, 可以避免转化过程中引入缺失突变, 精确地对单链DNA中的碱基进行编辑[68]。此系统可检验微藻单碱基改变对微藻性状的影响。Cas9n(Cas9 nickase)和反转录酶连用构成引导编辑(CRISPR prime edition)系统, 可打断特定DNA位点的一条链, 引入一段序列, 高效造成插入突变。Cas9n是单链内切酶, 不产生双链DNA断裂, 最高只能精确插入约40 bp, 删除最高约80 bp[68-69]。

微藻生长快, 易培养, 基因组相对简单。莱茵衣藻、三角褐指藻、微拟球藻、小球藻等许多微藻都是基因工程研究常用微藻藻种。优秀藻种是高效生产多种多样物质的基础。基因编辑技术就是微藻藻种遗传改良的技术之一。CRISPR/Cas9技术成功率高、易操作、成本低, 比TALEN、ZFN等应用更广泛。目前, 以CRISPR/Cas9系统为基础而衍生出的多种基因调控, 例如CRISPR激活、CRISPR prime编辑、CRISPR碱基编辑、编辑组蛋白标记、甲基化编辑等, 都可以成为日后进行微藻基因编辑的有力工具。因此, 如何整合现有编辑技术、修饰现有编辑技术、阐明微藻经济性状遗传基础、培育优质微藻藻种是重要的研究领域之一。

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Application of the CRISPR/Cas9 gene editing system in microalgae

LIU Li-xian, GUO Li, YANG Guan-pin

(College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Microalgae are a group of photosynthetic protists. They synthesize diverse high value-added materials, such as protein, docosahexaenoic acid, and astaxanthin, which are widely used as food additives and in health products, cosmetics, and animal feeds. Gene editing may serve as a novel tool for microalgal genetic studies and genetic improvement. The currently available gene editing tools include zinc-finger nucleases (ZFNs) system, transcription activator-like effector nucleases (TALENs) system, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) system (CRISPR/Cas). ZFN and TALEN are fusion proteins, which include an effector (DNA sequence recognizer) and an endonuclease. They target a specific region of DNA and cut the surrounding sequence. This editing system is tedious as the effector must be modified for diverse editing sites. In comparison, the newly emerging CRISPR/Cas technology is easy to operate and highly efficient. It requires only a small guide RNA to be designed for each site. It can simultaneously knock out a single or a set of genes, mediate the insertion of a DNA fragment into a specific site, and its variants can interfere, activate, or switch off and switch on the expression of a gene. Prime editing and RNA editing have been developed, and diverse editing tools are being established for microalgae. In this paper, we reviewed the current status and application of the CRISPR/Cas9 editing system in microalgae.

microalgae; gene editing; CRISPR/Cas9

Oct. 14, 2022

[Supported by Key R&D Program of Shandong Province, China, No. 2022LZGC004, National Key R&D Program of China, No. 2022YFF1102300 and the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 202262001]

Q789

A

1000-3096(2023)8-0101-11

10.11759/hykx20221014001

2022-10-14;

2022-11-08

山东省重点研发计划(2022LZGC004), 国家重点研发计划(2022YFF1102300), 中央高校基本科研业务费专项(202262001)资助

刘丽娴(1998—), 女, 山东青岛人, 硕士, 主要从事海洋微藻遗传学研究, E-mail: liulxouc@163.com; 杨官品(1963—), 通信作者, 男, 湖北荆州人, 主要从事海洋生物方面的研究 E-mail: yguanpin@ouc.edu.cn

(本文编辑: 赵卫红)