不同产地青花椒精油的化学成分分析及体外抑制幽门螺杆菌研究

刘薇，赵孔发，张锋伦，苟仕坤，何银江，聂韡，马世宏，单承莺*

（1.中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 211111；2.江苏省天然香料工程技术中心，江苏 南京 211111；3.昭通市大成农业开发有限责任公司，云南 昭通 657100）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb. et Zucc.）为芸香科（Rutaceae）花椒属植物青花椒的成熟果皮，主产于我国云贵川等西南地区［1］。青花椒具有独特浓郁的香气和口感，在我国被广泛用作烹饪和食品加工行业的食品辛香料。同时，青花椒也在《中国药典》中被列为多种中药方剂中的有效成分，具有温中止痛的作用，用于治疗头痛、腹痛、牙痛、呕吐等疾病［2］。青花椒具有较高的营养价值，其主要含有挥发油、生物碱、香豆素、类黄酮、植物甾体和酰胺类化合物［3］。青花椒的香气来自于精油成分，主要包含烯醇类、酮类、烃类、酯类、醛类等挥发性化合物，这些均与青花椒的品质密切相关［4-5］。研究发现，不同品种青花椒精油的组成及含量是有差异的，同一品种的青花椒种植在不同地区，其精油组成和含量会因这些地区的海拔、光照、气候、温度和湿度等自然条件不同而有所差异［6］。现代研究表明，青花椒精油还可以对部分人体致病菌有一定的抑制作用，如大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等［7-9］。

幽门螺杆菌是一类微需氧革兰阴性菌，可在人体胃酸中生存，是最常见的传染性病原体之一，全球有50%以上的人口感染，我国感染人数超过6亿，并有逐年增加的趋势［10-11］。人感染幽门螺杆菌，可引起多种胃肠道疾病，如胃炎、胃十二指肠溃疡，严重时可发生胃粘膜相关性淋巴样恶性瘤及胃癌等消化系统疾病［12-13］。根除幽门螺杆菌可降低胃癌的发生风险，临床上最多采用的是三联、四联疗法治疗幽门螺杆菌，但由于抗生素滥用及治疗方案不规范等因素，幽门螺杆菌的耐药性和致病力逐渐上升，疗效也受到很大的影响［14］，因而寻求安全、高效的抗幽门螺杆菌的抑菌剂新药对现在临床药学尤为重要。中西医结合治疗提高幽门螺杆菌的根除率，可改善患者症状，目前，已有中药包括单味药、复方制剂、提取物或者单体成分用于抗幽门螺杆菌的治疗，如：姜成等研究了15味中药抑制幽门螺杆菌的药效作用，发现黄连的药效最佳［15］。青花椒是一种重要的药食两用资源，具有辛辣和芳香气味，利用的部位为其果实。迄今，尚未有青花椒精油对幽门螺杆菌抑制作用的报道，因而本文提取青花椒果中的精油，并研究其对幽门螺杆菌的抑制效果。

本研究采用水蒸气蒸馏法提取云南8个不同产地新鲜的青花椒精油，通过气相色谱-质谱法（Gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）法分析精油中可挥发性化学成分。同时选用滤纸片法测试青花椒精油对幽门螺杆菌的抑菌效果，以期为青花椒资源的品质评价、品种选择以及青花椒的综合利用开发提供参考。

1 材料

1.1 材料与试剂

新鲜青花椒品种的编号、名称和采样地点见表1，将新鲜的青花椒剪去枝叶，得到青花椒果实。

表1 青花椒品种的编号、名称和采样地点Tab.1 Number， name and sampling place of Z. schinifolium

菌株：人类胃粘膜活检标本中获得的幽门螺杆菌菌株（ATCC 43579），购自美国菌种保藏中心ATCC代理商上海百风生物科技有限公司。

试剂：丙酮，分析级，购自国药集团化学试剂有限公司；脑心浸液肉汤，生化试剂，购自北京普纳德科技有限公司；琼脂，试剂级，购自上海生工公司；氯化钠，分析级，购自国药集团化学试剂有限公司。

精油提取器（上海达丰玻璃仪器厂）；DZTW电子调温电热套（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；DHG-9143BS-III电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制药有限公司）；7820A-5975 MSD气相色谱-质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）；PL403电子天平（梅特勒托利多科技有限公司），CH-SQ50B三气培养箱（杭州川恒实验仪器有限公司）；96孔酶标板（康宁公司）；60 mm一次性无菌细胞培养皿（耐思生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 青花椒精油的提取

称取新鲜青花椒果实200 g，再按料液比1∶5加蒸馏水放入圆底烧瓶中，然后加热至产生蒸汽，开始计时提取精油，提取时间为1 h。收集精油，将收集的青花椒精油用干燥的NaCl分层除去多余的水分，4 ℃保存备用。

2.2 青花椒精油可挥发成分分析

采用Agilent HP-5气相毛细管色谱柱（30 mm ×0.25 mm，0.25 µm）高纯度氦气作为载气，载气流速为1.0 mL/min，分流比为120∶1。花椒精油采用丙酮稀释，稀释倍数为100倍。进样量1 µL，进样口温度设为250 ℃。采用程序升温方式进行分析：初始温度为80 ℃，该温度下保持6 min，接着以8 ℃·min-1的升温速率将温度升至180 ℃，维持10 min，然后以10 ℃·min-1的升温速率将温度升至250 ℃，维持20 min。质谱条件：电子轰击式离子源（EI），离子化能量、离子源温度和接口温度分别为70 eV、200 ℃和250 ℃，扫描方式为全扫描，质量扫描范围为35 ～ 550 m/z。

2.3 培养基制备

固体培养基由脑心浸液肉汤加琼脂组成，分别称取脑心浸液肉汤和琼脂7.7 g和3 g溶于200 mL超纯水中，高压灭菌冷却，倒平板，备用。保菌液的制备：将脑心浸液肉汤按比例加入30%甘油，高压灭菌冷却后，每1 mL分装于无菌冻存管中，储存温度为-80 ℃，备用［16］。

2.4 抑菌敏感性试验

采用纸片扩散法，以生理盐水（0.9%氯化钠）为阴性对照组，脑心浸液肉汤加琼脂配制固体培养基。用无菌棉签蘸取孵育72 h的菌种，制备含菌浓度为1×107～ 1×108cfu/mL的菌悬液。取100 µL菌悬液于平板中，酒精灯旁挥干后，在含菌平板中央放置滤纸片，滴加10 µL不同产地的青花椒精油使其完全浸透（每个产地的青花椒精油平行三份），用无菌镊子轻轻按压，于三气培养箱中（O2：5%；CO2：15%；N2：80%）37 ℃恒温培养48 h，记录每组纸片的抑菌圈直径（mm）。

2.5 最低抑菌浓度测定

采用稀释扩散法，50%无水乙醇作为阴性对照组，采用50%无水乙醇连续按2倍梯度稀释青花椒精油浓度为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg/mL于96孔板中。然后在各孔中加入100 µL的菌悬液，混匀，于三气培养箱中（O2：5%；CO2：15%；N2：80%）37℃恒温培养24 h。体式显微镜下观察各孔培养基表面，以孔内无菌生长为最低抑菌活性浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。采用测定青花椒精油抑制幽门螺杆菌的MIC浓度梯度的方法，分别移取100 µL菌悬液于固体平板上，37 ℃下培养24 h后，无菌生长的精油浓度即为最低杀菌浓度（Minimal bactericide concentration， MBC）值。

3 结果与讨论

3.1 不同产地青花椒品种精油含量分析

经水蒸气蒸馏法提取的云南8个不同地区的青花椒精油呈半透明液体，颜色为浅黄绿色，具有浓郁的青花椒特色香气。各产地青花椒提取的精油含量见表2，可以发现不同产地青花椒提取的精油含量存在差异。八个产地青花椒所提取的精油含量从高到低依次为：鲁甸青花椒1号、东川青花1号、东川青花椒2号、昭通转红椒、鲁甸青花椒2号、红河青花椒、丽江青花椒、香格里拉青花椒，它们的精油提取率分别为9.8、9.6、9.5、9.0、9.0、7.8、7.0、6.8 mL/100g，平均精油提取率为8.56%。青花椒精油的含量在一定程度上取决于其品种的优劣，本文不同产地青花椒提取率比之前文献报道采用水蒸气蒸馏法对青花椒精油的提取率高［17-18］，说明云南这八个产地的青花椒果质量均较好。

表2 不同产地青花椒品种精油含量Tab.2 The essential oil content of Z. schinifolium from different producing areas

3.2 不同产地青花椒品种精油成分分析

采用气相色谱和质谱联用技术分析得到8个产地青花椒提取的精油的总离子流图（图1），再利用美国国家标准与技术研究院标准谱库NIST17结合峰面积归一化法对精油中的各个组分进行定性分析和相对含量的计算，各个青花椒中所含的挥发性组分和相对含量如表3所示。从8种不同来源的青花椒精油中共鉴定出44种成分，已鉴定成分的峰面积之和占青花椒精油总峰面积的99%以上，其中不同产地青花椒精油的共有成分3种，分别为芳樟醇、D-柠檬烯和4-萜烯醇，这三种共有成分总相对质量分数均达到85%以上，其中红河青花椒精油达92.96%。从图1看出，8个产地的青花椒精油的主要峰群的整体图貌基本一致，具有较高的相似度。但是，青花椒精油成分含量之间依然存在一定差异，如香格里拉青花椒精油和昭通转红椒精油除了三种共有成分外，水合桧烯相对质量分数也较高，分别达3.43%和4.40%，而其他6种精油中不含该成分。另外鲁甸青花椒1号精油、红河青花椒精油和丽江青花椒精油中含有β-水芹烯，且占比例较高，分别达8.34%、3.41%和4.57%，其他品种中均未发现该物质。由表3可知，8个产地青花椒精油中芳樟醇含量最高，其中红河青花椒精油中芳樟醇含量达到87.64%，其他品种青花椒精油中芳樟醇含量也均大于72%。综上所述，芳樟醇、D-柠檬烯和4-萜烯醇是云南青花椒精油的主要成分，其中芳樟醇含量占比最大，同时产地差异会对青花椒精油的化学成分产生一定的影响，即使在同一省份，青花椒精油的成分也会因环境的影响而有所不同。

图1 不同产地青花椒精油总离子流图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of essential oil of Z. schinifolium from different producing areas

图2 不同产地青花椒精油抑制幽门螺杆菌抑菌圈图Fig.2 Inhibition zone diagram of Helicobacter pylori by essential oil of Z. schinifolium from different producing areas

表3 不同产地青花椒品种精油成分的GC-MS分析结果Tab.3 GC-MS analysis results of essential oil components in Z. schinifolium from different producing areas

3.3 不同产地青花椒精油对幽门螺杆菌的抑制活性分析

不同产地青花椒精油对幽门螺杆菌的抑制实验结果见表4，选取不同产地青花椒的3个平行样中一个样品对幽门螺杆菌的抑菌效果作为代表进行拍照。

表4 不同产地青花椒精油抑制幽门螺杆菌效果实验结果Tab.4 Experimental results on the inhibition of Helicobacter pylori by essential oil of Z. schinifolium from different producing areas

抑菌圈直径是判定抗生素敏感性的标准：抑菌圈直径大于15 mm为高度敏感抑菌；抑菌圈直径为10 ～ 15 mm属于中度敏感度抑菌；抑菌圈直径大小为5 ～ 10 mm属于低度敏感度抑菌表示抑菌圈直径小于5 mm或者是未出现明显的抑菌圈，无抑菌效果［19］。根据敏感度判定标准可以得出，8种产地的青花椒精油均对幽门螺杆菌具有高度敏感抑制作用，且抑菌圈的直径均大于25 mm，其中红河青花椒精油对幽门螺杆菌抑制最强，抑菌圈直径为33.2 mm。八个不同产地青花椒精油的芳樟醇含量分别为84.30%、81.53%、72.22%、77.97%、87.64%、85.72%、81.29%和83.32%，其抑菌圈直径大小平均值分别为31.3、28.2、25.5、26.5、33.2、30.3、27.4、30.3 mm，与芳樟醇含量成正比例关系，见图3。芳樟醇为无色液体，属于链状萜烯醇类，具有铃兰香气。研究发现，芳樟醇具有多种作用，可以用做香料、除臭剂、抗龋齿剂、抑菌剂等［20］，且具有抗菌杀虫的功效［21］。还有报道称芳樟醇对蛋白质具有破坏作用，使牛清蛋白荧光产生淬灭，改变牛清蛋白的蛋白质构象，降低α-螺旋含量［22］，同时也会损伤大肠杆菌的蛋白质二级结构，起到抑菌作用［23］。由此可知，青花椒精油中抑制幽门螺杆菌的成分很可能与芳樟醇有关。这8个产地青花椒精油中红河青花椒精油中芳樟醇的含量最高，且抑制幽门螺杆菌的抑菌圈直径最大，同时该地所产青花椒具有产量大、质量好、精油含量较高等优点。故后续选择以红河青花椒精油为原料开展幽门螺杆菌最小抑菌浓度研究。

图3 不同产地青花椒精油抑菌圈大小与芳樟醇含量对比图Fig.3 Comparison of the antibacterial circles and linalool content in essential oil of Z. schinifolium from different producing areas

3.4 MIC和MBC值的测定

将所选菌种在96孔板中培养之后，通过孔的澄清度来判定红河青花椒精油的最低抑菌浓度，结果表明红河青花椒精油对幽门螺杆菌的抑制作用较强，MIC为0.20 mg/mL。在MIC的基础上经过平板划线，得到红河青花椒精油的最低杀菌浓度MBC为0.39 mg/mL，结果见表5。

表5 红河青花椒精油的MBC值Tab.5 MBC values of Z. schinifolium essential oil from Honghe state

4 结论

4.1 精油提取率

采用水蒸气蒸馏法提取青花椒精油来计算精油得率，由计算结果可知，云南不同产地的8份样品青花椒精油得率不同。罗凯［25］等认为精油的含量在一定程度上反映了花椒的品质，并且国家现有青花椒和青花椒加工制品的相关标准中就是采用青花椒呈香物质（挥发油）的含量指标来衡量花椒品质的。来自昭通地区的三份样品（昭阳转红椒和鲁甸青花椒1号、2号）以及产自昆明市东川区的两份样品精油产率较高，开发价值较大；其中鲁甸青花椒1号精油产率最高为9.8 mL/100g。

4.2 成分分析

云南8个产地的青花椒精油共鉴别出的44种化合物，共有的3个已知组分为芳樟醇、D-柠檬烯和4-萜烯醇，其中芳樟醇在所有样品中相对含量最高。这三个共有成分的总相对质量分数均高达85%以上，分别为：产地1占90.53%；产地2占86.54%；产地3占83.34%；产地4占85.74%；产地5占91.38%；产地6占90.15%；产地7占87.99%；产地8占88.64%，推测不同产地的青花椒精油可能因产地的光照、气候、温度和湿度影响了这三种组分的比例。

4.3 幽门螺杆菌抑菌效果

云南8个产地的青花椒精油均对幽门螺杆菌具有高度敏感抑制作用，且抑菌圈的直径大小均大于25 mm。其中红河青花椒精油对幽门螺杆菌抑制作用最强，抑菌圈直径为33.2 mm，最小抑菌浓度为0.20 mg/mL，低于已有研究中荆芥属植物精油对幽门螺杆菌的最小抑菌浓度（MIC90为0.256 mg/mL）［24］，说明该地区的青花椒精油抑制幽门螺杆菌效果好。

综上，不同产地青花椒精油的化学成分存在一定差异，但均有抑制幽门螺杆菌的作用，且抑制幽门螺杆菌效果与精油中的芳樟醇含量成正相关性，由此推测青花椒精油中抑制幽门螺杆菌的成分很可能与芳樟醇有关。该结论为后期综合开发利用青花椒精油抑制幽门螺杆菌提供了理论依据。