经典名方温胆汤物质基准总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量测定

杨思雨，邹妍，李寅庆，4，张红梅

（1.上海中医药大学 中药学院，上海 201203；2.中药创新药物研发上海高校工程研究中心，上海 201203；3.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；4.河北省经典名方与现代中药质量过程控制重点实验室，河北 石家庄 051430）

在国家中医药管理局颁布的《古代经典名方目录（第一批）》中，温胆汤为第一批可进行复方制剂简化注册的经典名方。《备急千金要方》中关于温胆汤的记载为“半夏、竹茹、枳实各二两，橘皮三两，甘草一两，生姜四两，上六味㕮咀，以水八升煮取二升，分三服”［1］，主要用于治疗神经系统［2］、内分泌系统［3-4］、消化系统［5］、心血管系统［6］等疾病。

目前关于温胆汤及其加减方的报道，大多集中在临床应用及药理作用方面，对于质量控制方面的研究较少，主要集中在指纹图谱的研究［7-8］及代表成分的含量测定［9-10］，对于评价温胆汤的质量提供了一定的方法，但是对于温胆汤物质基准中所含化学成分无法整体了解，目前温胆汤大类成分研究只见于多糖类成分［11］的报道。经过前期研究以及查阅文献发现［9］，温胆汤中黄酮类成分最为丰富，是治疗高血压、动脉粥样硬化的主要活性成分［12］。黄酮类成分中又以柚皮苷和新橙皮苷含量为主，常作为评价温胆汤质量的指标成分，具有促进胃肠运动和抗溃疡等作用［13-14］。

紫外分光光度法（Ultraviolet and visible spectrophotometry， UV）适用于总黄酮的测定，具有操作简便快速，准确度高，精密度好的特点。目前黄酮类化合物测定法有直接测定法和比色法。比色法是将化合物加入显色剂后测定吸光度再进行换算测定的方法，常用的显色方法有NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法、AlCl3法、三乙胺法［15］。高效液相色谱（High performance liquid chromatography， HPLC）技术分辨率高、分析速度快且能够实现重复分析，药品检验时所需样品量少，在药品含量测定中有着较高的适用性［16］。

物质基准为经典名方制剂研发过程中的基础，是经典名方制剂生产工艺和质量标准研究的依据。本研究采用UV法测定温胆汤物质基准中总黄酮含量，同时采用HPLC法测定温胆汤物质基准中柚皮苷和新橙皮苷含量。为温胆汤的进一步研究和开发提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695 高效液相色谱仪（美国Waters公司）； Reprosil-Pur ODS-3 色谱柱（德国迈可公司）；UES1810001 紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；JYH-A30A1 全自动煎药壶（广东佛山小熊电器有限公司）；7670571 台式真空冷冻干燥机（美国拉博科公司）；CP224C 电子天平（d = 0.1 mg）［奥豪斯仪器（常州）有限公司］；KQ5200DE 超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药材

色谱纯乙腈、甲醇、甲酸，均购自上海泰坦科技有限公司；水为娃哈哈纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司。对照品柚皮苷（批号：110722-201815；质量分数为98%）、新橙皮苷（批号：Z31J6L2067；质量分数为98%）均购自上海源叶生物科技有限公司。温胆汤物质基准（自制，批号：20210101、20210102、20210103）。乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝均购自上海泰坦科技有限公司；氯化铝购自上海润捷化学试剂有限公司；三乙胺购自国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 温胆汤物质基准制备

称取半夏、竹茹、枳实各6 g，陈皮9 g，甘草3 g，生姜12 g，加水1600 mL，先武火（500 W）煮沸后转文火（200 W）煎煮，约3.5 h后，以80目滤布趁热过滤，滤液放凉后加水至400 mL，得到温胆汤提取液。提取液冷冻干燥（预冻温度：-80℃；冷阱温度：-45℃；真空度： ＜ 100 Pa），得到温胆汤冻干粉，作为温胆汤物质基准对应实物。

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 对照品溶液制备

取柚皮苷对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解，并稀释至刻度，制成202.2 µg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备

称取温胆汤物质基准20 mg，加入70%乙醇溶解，并稀释至10 mL，称定重量，超声30 min，称重，补足减失的重量，滤过。精密吸取过滤液1 mL，加70%乙醇定容至25 mL，即得。

2.2.3 总黄酮测定方法考察

总黄酮含量作为质量控制指标，常采用紫外-可见分光光度法测定。比色法应用较广的有NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法、AlCl3法、三乙胺法。本研究考察并比较以上三种比色法与直接测定法对温胆汤物质基准中总黄酮含量测定的影响，并确定含量测定方法。

2.2.3.1 直接测定法

量取浓度为202.2 µg/mL的柚皮苷对照品溶液1 mL，精密称定，加 70%乙醇定容至10 mL。称取温胆汤对应实物20 mg，加入70%乙醇，定容至10 mL，超声30 min，滤过，量取过滤液1 mL加70%乙醇定容至25 mL。在波长200 ～ 800 nm内进行扫描测定，见图1。

图1 直接测定法全波长扫描图Fig.1 Full spectrum scan of direct determination method

2.2.3.2 NaNO2-A（lNO3）3-NaOH法

量取浓度为202.2 µg/mL的柚皮苷对照品溶液0.03 mL，加入5% NaNO2溶液0.8 mL，10% Al（NO3）3溶液0.8 mL，4% NaOH溶液4 mL，加70%乙醇定容至10 mL。称取温胆汤对应实物20 mg，加入70%乙醇，定容至10 mL，超声30 min，滤过，取滤液0.03 mL，加入5% NaNO2溶液0.8 mL，10% Al（NO3）3溶液0.8 mL，4% NaOH溶液4 mL，加70%乙醇定容至10 mL。在波长200 ～ 800 nm内进行扫描测定，见图2。

图2 硝酸铝显色法全波长扫描图Fig.2 Full spectrum scan of NaNO2-Al（NO3）3-NaOH method

2.2.3.3 AlCl3法

称取AlCl30.13 g于10 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度线，制成0.1 mol/L三氯化铝溶液；醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为5.2）制备，甲液为0.2 mol/L醋酸（量取114 µL冰醋酸用蒸馏水稀释至10 mL），乙液为0.2 mol/L醋酸钠（称取醋酸钠0.2722 g用蒸馏水稀释至10 mL），量取甲液1.05 mL，乙液3.95 mL，混合，最后用蒸馏水稀释至10 mL。量取浓度为202.2 µg/mL的柚皮苷对照品溶液0.6 mL，加入0.1 mol/L三氯化铝溶液2 mL，醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为5.2）2 mL，加 70%乙醇定容至10 mL。称取温胆汤物质基准20 mg，加入70%乙醇，定容至10 mL，超声30 min，滤过，取滤液0.4 mL，加入0.1 mol/L三氯化铝溶液2 mL，醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为5.2）2 mL，加 70%乙醇定容至10 mL。在波长200 ～ 800 nm内进行扫描测定，见图3。

图3 三氯化铝显色法全波长扫描图Fig.3 Full spectrum scan of AlCl3 method

2.2.3.4 三乙胺法

量取浓度为202.2 µg/mL的柚皮苷对照品溶液0.6 mL，加1%三乙胺乙醇溶液4 mL，加 70%乙醇定容于10 mL。称取温胆汤对应实物20 mg，加入70%乙醇，定容至10 mL，超声30 min，滤过，取滤液0.5 mL，加1%三乙胺乙醇溶液4 mL，加70%乙醇定容至10 mL。在波长200 ～ 800 nm内进行扫描测定，见图4。

图4 三乙胺显色法全波长扫描图Fig.4 Full spectrum scan of triethylamine method

按照上述方法分别测定温胆汤物质基准总黄酮含量（n=3），结果见表1。四种测定方法的供试品溶液和对照品溶液峰的吸收特性均无明显差异。但NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法测定总黄酮含量时，容易受溶剂加入量和加入时间等影响，稳定性差，最大吸收波长处有杂峰干扰，需要现配现用，且重复性差；以AlCl3法测定总黄酮含量时，最大吸收波长处吸收峰较钝，最大吸收峰重复性差；三乙胺法与直接测定法最大吸收波长重叠，未见红移，因此无法判断是试样吸收还是反应产物吸收。考虑直接测定法偏差较小，重复性较好，且操作简便，因此选择直接测定法测定总黄酮的含量，直接测定法在284 nm有最大吸收，且干扰较小，故选择284 nm作为测定波长。

表1 不同显色方法测定温胆汤总黄酮含量Tab.1 The determined content of total flavonoids in samples by different color developing method

2.2.4 标准曲线绘制

精密量取柚皮苷对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解，并稀释至刻度线，摇匀。按紫外-可见分光光度法（《中国药典》2020年版四部通则0401）在284 nm波长处测定吸光度（n=3），以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程，得到柚皮苷标准曲线Y= 24.462X+ 0.116（r= 0.9996），且柚皮苷在20.22 ～ 80.88 µg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，见图5。

图5 柚皮苷对照品标准曲线Fig.5 Standard curve of naringin reference substance

2.2.5 精密度试验

按“2.7”项下制备供试品溶液，连续测定六次，结果测得供试品溶液的吸光度的RSD为0.18%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验

取同一批次温胆汤对应实物6份，按照“2.7”项下同法操作，测定各样品吸光度，计算总黄酮含量，测得总黄酮含量的RSD为1.29%，表明重复性良好。

2.2.7 稳定性试验

按“2.7”项下制备供试品溶液，于室温分别放置0、20、40、60、80、100 min，计算总黄酮平均含量的RSD为0.07%，表明样品溶液在100 min内稳定。

2.2.8 加样回收率试验

取已知总黄酮含量的温胆汤物质基准9份，每份约0.5 mL，分别按已知总黄酮量的80%、100%、120%加入柚皮苷对照品溶液，加入70%乙醇定容至25 mL，加样回收率结果见表2。

表2 加样回收率试验考察结果Tab.2 Results of recovery test

2.2.9 提取条件优化

2.2.9.1 溶媒种类考察

称取温胆汤物质基准20 mg，分别加入水、70%甲醇和70%乙醇并定容至10 mL，超声30 min，过滤，量取1 mL置于25 mL容量瓶中，加入对应的提取溶媒至刻度线，摇匀。分别测定其吸光度值，按“2.3.4”项下标准曲线计算总黄酮含量，依次为11.42%、14.22%、14.96%，结果显示当提取溶媒为70%乙醇时，总黄酮含量测定值最高。

2.2.9.2 溶媒浓度考察

称取温胆汤物质基准20 mg，分别加入30%、50%、70%、90%、100%乙醇并定容至10 mL，超声30 min，过滤，量取1 mL置于25 mL容量瓶中，加入对应不同浓度的乙醇至刻度线，摇匀。分别测定其吸光度值，按“2.3.4”项下标准曲线计算总黄酮含量，依次为14.61%、12.44%、14.96%、12.66%、7.94%，结果显示，当提取溶媒浓度为70%乙醇时，总黄酮含量测定值最高，见图6。

图6 温胆汤物质基准总黄酮含量提取溶媒浓度考察Fig.6 The determined content of total flavonoids in Wendan decoction from different extraction solvent concentration

2.2.9.3 提取时间考察

称取温胆汤物质基准20 mg，加入70%乙醇并定容至10 mL，分别超声提取10、20、30、40、50 min，摇匀，并过滤，量取1 mL置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度线，摇匀。分别测定其吸光度值，按“2.3”项下标准曲线计算总黄酮含量，依次为12.97%、14.03%、14.96%、13.96%、12.32%，结果显示当提取时间为30 min时，总黄酮含量值最高，见图7。

图7 温胆汤物质基准总黄酮提取时间考察Fig.7 The determined content of total flavonoids in Wendan decoction from different extraction time

2.3 柚皮苷和新橙皮苷的含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱为Reprosil-Pur ODS-3（5 µm，250 mm ×4.6 mm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水；梯度洗脱：0 ～ 35 min，0% ～ 19.5%乙腈，35 ～ 36 min，19.5% ～35%乙腈，36 ～ 60 min，35% ～ 45%乙腈；检测波长283 nm；柱温30℃；体积流量为0.8 mL/min；进样量为5 µL。色谱图见图8。

图8 柚皮苷和新橙皮苷含量测定图谱Fig.8 Chromatographic determination of naringin and neohesperidin

2.3.2 对照品溶液制备

取柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，分别制成质量浓度为0.047、0.031 mg/mL的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备

称取0.1 g温胆汤冻干粉，加水溶解定容至10 mL，14000 r/min离心15 min，吸取上清液，过亲水性滤膜（0.22 µm），作为基准样品对应实物供试品溶液备用。

2.3.4 线性关系考察

精密称取柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，用甲醇稀释成6种不同质量浓度的系列对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得到柚皮苷的回归方程为Y= 20193513.70X- 6637.8209，r= 0.9998，且柚皮苷在0.01～ 0.51 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系；新橙皮苷的回归方程为Y= 25607167.53X-77152.8199，r= 0.9998，且新橙皮苷在0.01 ～0.50 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验

按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，分别进行日内精密度和日间精密度测定，柚皮苷、新橙皮苷日内精密度峰面积RSD分别为0.33%、0.83%，柚皮苷、新橙皮苷日间精密度峰面积RSD分别为0.77%、0.74%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验

按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，测得柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD分别为0.74%、1.22%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验

按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、48 h按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，测得柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD分别为0.73%、1.14%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验

按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别加入一定量的对照品，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，计算可知柚皮苷、新橙皮苷平均加样回收率分别为2.47%、1.59%，见表3。

表3 柚皮苷和新橙皮苷加样回收率结果Tab.3 The extraction recovery test of naringin and neohesperidin

2.4 样品含量测定

分别制备3批温胆汤物质基准，按照“2.2.2”项下供试品溶液处理方法，在284 nm波长处测定吸光度值，计算样品中总黄酮含量；按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中柚皮苷和新橙皮苷的含量，见表4。结果显示建立的含量测定方法操作简单，结果准确，重复性好。总黄酮平均含量为15.03%，柚皮苷和新橙皮苷的平均含量分别为22.78 mg/g和9.75 mg/g。

表4 温胆汤物质基准总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量测定结果Tab.4 The content determination of total flavonoids， naringin and neohesperidin of Wendan Decoction

3 讨论

3.1 指标成分的选择

目前，总黄酮含量测定的对照品大多为芦丁［9］，任珊珊等［15］研究表明进行总黄酮含量测定时，所选对照品应尽可能真实反应待测样品中黄酮类成分的结构和组成。何珺等［17］研究表明在测定总黄酮含量时，当药材或制剂中不含芦丁或芦丁含量极少时，应尽量选用自身成分作为对照。经过前期研究发现温胆汤中大多为二氢黄酮类结构，柚皮苷在温胆汤中含量较高，又能很好的代表复方中黄酮类成分，因此采用柚皮苷作为UV总黄酮含量测定的对照品。黄酮类成分是温胆汤中的主要成分，柚皮苷和新橙皮苷作为其黄酮类成分的代表［18］，具有抑制平滑肌收缩的功能，与中医理气功效相符，是发挥药效的重要物质基础［19-20］。因此选择柚皮苷和新橙皮苷作为HPLC含量测定的指标成分。

3.2 总黄酮提取因素确定

本实验分别对溶媒种类、溶媒浓度、提取时间三个因素进行考察，选择总黄酮提取率最高的提取条件，最终确定温胆汤物质基准供试品溶液制备方法为取温胆汤物质基准20 mg，加入70%乙醇溶解，并定容至10 mL容量瓶，超声30 min，滤过，精密吸取过滤液1 mL，加70%乙醇定容至25 mL，即得。

3.3 柚皮苷和新橙皮苷色谱条件优化

本研究以各成分分离度、保留时间、峰型为指标，比较了不同流动相比例（0.05%甲酸-水、0.10%甲酸-水、0.15%甲酸-水）、不同波长（250、260、283 nm）、不同流速（0.6、0.8、1.0 mL/min）、不同色谱柱（Reprosil-Pur ODS-3、Alltima TM C18、Shimadzu-VP ODS）、不同柱温（25、30、35℃），最终确定色谱条件为以乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱，检测波长283 nm，流速0.8 mL·min-1，色谱柱为Reprosil-Pur ODS-3，柱温为30℃。

3.4 检测结果分析

目前对温胆汤大类成分的研究仅有多糖类，多糖类成分占比较少，为2% ～ 4%。本研究首次采用紫外分光光度法对温胆汤总黄酮类成分进行含量测定，结果显示，温胆汤物质基准中总黄酮平均含量为15.03%，高于多糖类成分，为温胆汤物质基准中主要化学成分。进一步采用高效液相色谱法对温胆汤物质基准中两个主要黄酮类活性成分柚皮苷和新橙皮苷进行定量研究，结果显示，柚皮苷和新橙皮苷的平均含量分别为22.78 mg/g和9.75 mg/g。

本实验分别通过建立UV法和HPLC法分别测定了温胆汤物质基准中总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量。经方法学验证，测定方法符合定量分析要求，操作简单，重复性好，为温胆汤质量标准的提升提供依据。