酵母发酵对米糠挥发性风味物质及营养特性的影响

廖 娟，殷智华，李嘉宇，杨 涛,

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙 410004；2.稻谷及副产物深加工国家工程研究中心，湖南长沙 410004）

米糠是稻谷加工美白、抛光过程中的主要副产物[1]。米糠营养均衡，含有多种天然活性成分，在降血糖、降血脂，抗炎、抗氧化，预防心血管疾病上具有重要作用[2]。但因其油脂含量较高，极易氧化酸败，产生不良风味，影响了米糠产品在食品工业中的开发和利用[3]，常被用作饲料和发酵培养基，或被直接丢弃，造成资源浪费。改良米糠风味对于促进米糠的加工利用具有重要意义[4]。目前米糠的加工方式主要分为理化加工和生物加工。微生物发酵是最常用的米糠生物加工技术，指利用微生物的代谢作用来分解原料中的有机物，形成多种具有特殊香气的小分子物质如醇类、酯类等，从而改善产品风味，提高产品的营养价值。

微生物发酵被广泛应用在提高稻谷营养价值和功能性中。Zhao 等[5]研究发现使用乳酸菌发酵米糠可以增加膳食纤维、降低植酸的含量，提高营养价值。Astuti 等[6]发现少孢根霉固态发酵使米糠挥发性化合物增加了4 种，使米糠产生了发酵味，增强了酸败、烟熏和霉味。Nealon 等[7]发现长双歧杆菌发酵的米糠可以调节对肠道和整体健康重要的多种代谢途径。Kim 等[8]发现米糠经酵母菌发酵后具有降血压和抗疲劳等功效。冯海燕[9]利用高产纤溶酶的枯草芽抱杆菌对米糠进行固态发酵，提高了纤溶酶的产量，并降低了抗营养因子植酸的含量，整体提高米糠的营养价值。然而在已有的微生物发酵米糠研究中，主要集中在提高米糠的营养价值上，而对米糠风味的改善方面提及较少，且一些微生物发酵过程中容易产生异味从而影响米糠的口感和风味。

实验室前期研究发现相比于根霉、乳酸菌发酵，酵母发酵更适合用于改善米糠风味。本实验以经过稳定化处理的米糠为原材料，通过酵母对米糠进行发酵，气相色谱-质谱联用法对米糠发酵过程中的挥发性物质组成和含量进行分析，结合正交偏最小二乘分析确定影响米糠发酵前后风味的关键性挥发性物质。最后对发酵米糠粉进行感官评价验证和营养组成变化的探究，为酵母发酵米糠风味研究以及米糠深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜米糠 湖南省金健米业有限责任公司；酵母菌粉 安琪酵母股份有限公司；所有分离用有机溶剂 均为国产分析纯。

GC2030 气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；JH-H5 快速水份测定仪 泰州市宜信得仪器仪表有限公司；YXQ-LS-75G 高压灭菌锅 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；B01-10NA 型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠样品制备 按照石海鸽等[10]的方法，将新鲜米糠的水分调整至24%，平铺于玻璃培养皿中，800 w 微波75 s。冷却，过80 目筛，装入自封袋中真空备用。

1.2.2 发酵米糠样品制备 分别称取10 g 米糠粉，加入15 mL 水，在115 ℃灭菌30 min，摇散冷却，接种1%（w/w）酵母菌、30 ℃发酵0、12、18、24、30 h，取样。

1.2.3 顶空-固相微萃取操作方法 参考高晨[11]的方法，称取2 g 样品装入20 mL 萃取瓶中，调节温度为60 ℃，将SPME 针头插入顶空瓶中平衡5 min 后，轻轻推出纤维头，保持距样品1 cm 左右提取挥发性风味成分；萃取40 min 后将萃取头轻轻推回，拔出进样针，插入GC 进样口缓慢推出纤维头。解析条件为250 ℃，无裂解模式解析5 min。

1.2.4 气相色谱-质谱联用条件

1.2.4.1 色谱条件 色谱柱：DB-WAX；进样口温度250 ℃；升温程序：初始温度40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min 升到120 ℃，再以5 ℃/min 升到50 ℃，再以15 ℃/min 升到230 ℃，保持3 min。

1.2.4.2 质谱条件 电子电离（Electron Ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，质量扫描范围33～400 m/z；调谐文件为标准调谐；数据采集为全扫描模式。

1.2.5 感官评价定量描述分析 感官评价定量描述分析（Quantitative Descriptive Analysis，QDA）是利用统计方法对感官测得的数据进行分析，为一种定性定量相结合的描述分析检验方法[12]。由16 名本实验室（8 名女性，8 名男性）经过训练的人员组成感官评价小组，不同发酵阶段的米糠样品取相等质量于烧杯中，随机给样品编号，样品温度和室温均在20～25 ℃，对样品提出各自的描述词，经讨论确定样品的感官描述词、定义及参比样的选择和浓度，最终参比样的选择如表1 所示，对评价得分及香气特征描述词进行均一化处理，处理结果采用雷达图表示。

表1 QDA 法确定的描述词及其定义以及参比样Table 1 Descriptors determined by the QDA method,their definitions and reference samples

1.2.6 米糠水分测定 使用水分测定仪对冷冻干燥后的米糠粉进行水分含量的测定，称取3.00 g 米糠粉于快速水分测定仪器皿中，105 ℃干燥至恒重，记录水分含量。

1.2.7 米糠灰分测定 采用GB 5009.4-2016 食品中总灰分的测定[13]。

1.2.8 膳食纤维含量测定 采用GB 5009.88-2014酶重量法进行测定[14]。

1.2.9 米糠蛋白质含量测定 采用GB 5009.5-2016凯氏定氮法进行测定[15]。

1.2.10 米糠淀粉含量测定 采用GB 5009.9-2016酶水解法进行测定[16]。

1.2.11 米糠脂肪含量测定 采用GB 5009.6-2016酸水解法进行测定[17]。

1.3 数据处理

采用Origin Pro 2019 软件作图；TBtools 绘制热图；SIMCA14.1 软件进行PLSDA 分析，计算预测变量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP）；并结合SPSS22.0 软件进行单因素分析，以P<0.05，VIP≥1 为条件筛选差异挥发性组分；实验均进行3 次重复。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中米糠挥发性物质的鉴定

为研究酵母发酵对米糠挥发性物质的影响，利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱技术对发酵过程中米糠挥发性风味物质及相对含量进行分析鉴定。由表2 可知，共检测到75 种挥发性风味物质，其中醛类化合物14 种、酮类化合物13 种、醇类化合物17 种、酯类化合物7 种、烃类化合物7 种、酸类化合物6 种和其他类化合物11 种。

表2 发酵过程中米糠挥发性物质种类及相对含量Table 2 Types and relative contents of volatile substances in rice bran during fermentation

由图1 可知，未发酵米糠中醛类物质的种类和含量最为丰富，共有14 种，相对含量占总比例的35.99%。其中己醛、壬醛的含量最高。随着发酵时间的增加，醛类物质含量呈现明显下降趋势，发酵30 h 时醛类物质占比5.52%。醛类物质是由脂质氧化而成的。未发酵米糠中含有大量醛类物质，可能是米糠在生产加工时经过研磨造成米糠发生一定程度的脂肪氧化[18]，己醛由脂肪氧化产生，常被视为大米陈化指标，是导致大米不愉快气味的主要原因[19]发酵过程中由于酵母的代谢影响，醛类物质容易发生还原反应形成对应的醇类物质，因此醛的相对含量明显降低。这一结果与Yi 等[20]利用植物乳杆菌发酵米粉30 h 使醛类物质由53.6%降低到11.2%相类似，醛类物质由于气味阈值较低，在所有类别中对香气贡献最大。这些醛类物质的减少可以有效降低米糠的难闻气味。

图1 发酵过程中米糠挥发性物质相对含量变化（A）、种类数量变化（B）Fig.1 Changes in the relative content of volatile substances of rice bran during fermentation (A) and changes in the number of species (B)

在发酵过程中醇类物质的相对含量逐渐增加，未发酵米糠中的醇类物质占比为14.21%，发酵30 h时米糠中的醇类物质占比达到60.87%。2-甲基-1 丙醇、1-丁醇、1-庚醇、2,3-丁二醇表现出明显的上升趋势，其中2,3-丁二醇作为一种天然的芳香剂被描述为水果，奶油，黄油味[21]，在未发酵米糠中未检出。未发酵米糠和发酵米糠中醇类物质含量的显著差异可能是由氨基酸代谢或脂肪酸代谢产生，杨艳丽等[22]认为某些类型的醛可以在发酵过程中还原为醇或氧化成有机酸，从而导致醇含量增加。醇类物质通常具有较高的阈值，但与香气成分密切相关[23]，它们可以与有机酸形成酯类化合物，有利于改善米糠风味特征[24]。

随着发酵进行酮类物质的种类由9 种增加到13 种。发酵过程中产生的2,3-戊二酮和2,3-己二酮，可以赋予米糠黄油焦糖风味[25]。酮类物质主要是脂质自动氧化和美拉德反应的产物，具有令人愉悦的气味，如水果味、香蕉味、焦糖味和坚果味[26]。发酵过程中酮的种类数量和相对含量提高，可能由醇氧化、酯分解或微生物氧化形成[27]。

发酵前后米糠酯类含量变化不显著，但种类增加。发酵过程中产生的壬酸乙酯具有果香及玫瑰样香气的酒香[28]，可以改善米糠风味。酯类物质具有果味，主要由醇和脂肪酸酯化形成[29]，可以减轻脂肪酸带来的异味。烷烃类物质多数由于石油污染或土壤污染而来，且香气强度弱，对米糠中香气贡献少。酸类物质本实验检出含量少，且多为高沸点直链酸，对米糠香气贡献小。

2.2 PLS-DA 模型的建立

为进一步分析发酵过程中的挥发性成分的变化。以75 个挥发性物质组分作为因变量，不同发酵时间作为自变量，通过PLS-DA 分析（图2A），可以实现对不同发酵时间米糠挥发性成分有效区分。本次分析中的自变量拟合指数（R2X）为0.85，因变量拟合指数（R2Y）为0.99，模型预测指数（Q2）为0.937，R2和Q2超过0.5 表示模型拟合结果可接受[30]。经过200 次置换检验（Permutation Test），如图2B，Q2回归线与纵轴的相交点小于零，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，认为该结果可用于发酵过程中米糠挥发性成分鉴别分析。

图2 不同发酵时间米糠挥发性物质PLS-DA 得分图（A）、模型交叉验证结果（B）Fig.2 PLS-DA scores of rice bran at different fermentation times (A),model cross-validation results (B)

米糠酵母发酵各个时期主要的挥发性成分在PLS-DA 图上有明显的区分。未发酵样品位于第四象限，而发酵后样品位于二、三象限。说明该模型可以对发酵前后米糠挥发性物质进行区分。因此，本模型对米糠发酵不同阶段的挥发性风味物质具有良好的稳定性和预测性。

为了进一步表征不同发酵阶段米糠样品挥发性化合物之间的差异，计算并检验了PLS-DA 模型的变量投影重要性（VIP）得分（见表2），VIP 值越大，说明在发酵不同阶段该挥发性化合物的差异越显著。

2.3 发酵过程中米糠关键挥发性物质分析

为了进一步分析不同挥发性成分对区分不同发酵时间米糠的贡献率，选择P<0.05 且VIP>1 的物质，筛选出15 种发酵过程中米糠的差异挥发性成分，其中醛类5 种、酮类3 种、醇类4 种、酯类1 种、其他2 种。为了更加直接地区分不同发酵阶段下米糠特征挥发性化合物的变化，依据每种风味物质的相对含量绘制热图，将不同发酵阶段下米糠样品与15 种挥发性化合物的关系进行可视化。结果如图3 所示，苯甲醛主要由苯丙氨酸降解产生，具有一种特殊的苦杏仁味[31]，庚醛有一种强烈的难闻的脂肪气味，壬醛则呈现脂肪氧化酸败的哈喇味[32]。苯乙烯、己醛、苯甲醛、庚醛、壬醛这些带来不愉快气味的物质[33]，随着米糠的发酵，含量明显降低。2-庚酮、1-壬醇、壬酸乙酯、乙醛、乙偶姻、1-戊醇、2-甲基-1-丙醇、2,3-丁二醇、2,3-戊二酮、2,3-己二酮这些给米糠带来米香、奶油、水果、玫瑰等愉悦气味的物质[34]，随着发酵的进行明显增加。

图3 不同发酵时间米糠关键挥发性物质聚类热图Fig.3 Heat map of clustering of key volatiles of rice bran at different fermentation times

2.4 发酵对米糠感官评价的影响

对酵母发酵米糠不同发酵时间段的米糠进行QDA 感官评价，得到不同发酵时间段的米糠风味剖面图，图4 可知，未发酵米糠具有较强烈的酸味与哈喇味，异味感较重且无香气，综合评分很低，经过发酵后米糠的酸味、哈喇味减弱，甜香、果香、酒香增强。发酵18、24、30 h 后的米糠风味剖面图具有一定相似性，体现在甜香、果香、酒香方面得分突出，尤其是发酵18 h 的米糠在甜香、果香方面最为突出，故发酵18 h 的米糠在综合评分上获得最高分，其味道可被大部分小组成员接受，这一结果与米糠中挥发性物质含量的测定结果一致，甜味、果香更为突出的发酵18 h 的米糠其2-庚酮、1-壬醇、壬酸乙酯、乙偶姻的含量都高于其他发酵时间米糠。

图4 不同发酵时间米糠感官评价雷达图Fig.4 Radar chart for sensory evaluation of rice bran at different fermentation times

为了进一步确定挥发性物质和香气之间的关系，使用Pearson 相关性分析了发酵过程中关键挥发性物质与香气之间的相关性。如表3 所示，米糠关键挥发性物质和香气描述之间均有较高相关性，说明米糠关键挥发性物质含量的变化对米糠香气的影响显著。其中苯乙烯、己醛、苯甲醛、庚醛与米糠的酸味、哈喇味具有显著正相关性，2-庚酮、壬酸乙酯、乙偶姻、2-甲基-1-丙醇、2,3-丁二醇、2,3-己二酮与米糠的甜味、果香具有显著正相关。壬醛、壬酸乙酯对米糠的综合评分影响最为显著。

表3 米糠挥发性物质与香气描述之间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between volatile substances of rice bran and aroma description

2.5 发酵对米糠主要营养成分的影响

根据上述结论，将发酵18 h 的米糠与未发酵米糠主要营养成分对比。表4 为未发酵和发酵18 h 米糠的主要营养物质含量比较。从表中可以看出，发酵米糠粉中的膳食纤维含量较未发酵米糠提升了18.21%，蛋白质含量提升了38.41%，淀粉含量降低了29.67%，脂肪含量降低了26.50%。发酵过程中蛋白质和膳食纤维含量的提升，这一结果也与Wu[35]、Sukma 等[36]的研究结果相符合。酵母发酵米糠不仅改善了米糠风味，且米糠蛋白质、膳食纤维含量的显著提升以及脂肪含量的降低还提高了米糠的营养价值。

表4 发酵前后米糠基本营养物质组成对比（%）Table 4 Comparison of basic nutrients in rice bran before and after fermentation (%)

3 结论

本文研究了酵母发酵米糠过程中挥发性风味物质、香气特征以及主要营养成分的变化。结果表明酵母发酵能够改变米糠挥发性物质的组成，米糠中醛类物质含量降低，醇类物质含量增加，发酵后增加了米糠酒香、果香、甜味等香气，提高了米糠综合评分，改善了米糠的风味品质。发酵18 h 的米糠营养成分组成比例改变，使米糠更具有营养价值。本文还指出了发酵米糠中挥发性物质与香气之间的相关性，发现了对米糠风味影响显著的挥发性物质。这对于从改善米糠风味方面来提高米糠利用价值具有重要意义。未来需要对米糠发酵过程中风味物质的形成机制进一步研究，更好地利用微生物发酵来提高谷物的食用价值和经济价值。