miR-556-3p通过调控PTEN/AKT信号通路影响肝细胞癌的转移活性*

仲金龙,施 琳

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌类型,在癌症导致的死亡原因中排名第三位[1,2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性、短的非编码RNA分子,具有重要的基因调节因子的功能[3,4]。研究证据表明,miRNA的生物学功能与许多人类疾病有关,包括癌症[5]。通常,人类癌症miRNA位于基因组断点区域,在肿瘤发生和发展过程中发挥肿瘤抑制基因或肿瘤促进基因的作用[6]。最近的研究表明,miRNA表达在多种癌症中都有发现,包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌和HCC等[7-9]。最近研究发现肝癌细胞的静脉转移与多种miRNA相关,miR-556-3p就是其中之一[10,11]。同时,与过表达miR-556-3p组相比,miR-556-3p低表达与肿瘤复发和患者较低的生存率密切相关。体外研究表明miR-556-3p能够降低肝癌细胞生长[12,13]。因此,本研究通过探索miR-556-3p与HCC发生发展的关系,以期为HCC的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 肝癌组织、细胞和试剂 2020年3月～2022年2月我院诊治的HCC患者86例,获得所有患者书面知情同意书后,经我院医学伦理委员会批准开展研究。手术期间收集部分切除的HCC组织和癌旁肝组织,立即置于冷冻并保存在液氮中。肝癌细胞系HepG2 和正常肝细胞系LO2购自中国科学院细胞生物学研究所。RPMI-1640培养基(Gibco,Maryland,USA);Lipofectamine 2000 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA);miR-556-3p mimic、miRNA NC、磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)siRNA和PTEN cDNA(美国Invitrogen公司);TRIzol试剂(美国Invitrogen公司);抗PTEN、抗β-actin、抗磷酸化蛋白激酶B (protein kinase B,p-Akt)和抗AKT抗体(美国Abeam公司);CCK-8溶液(北京索莱宝);免疫组化试剂盒(杭州联科生物)。

1.2 细胞转染 细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、37℃、5% CO2条件下培养。取对数生长期的细胞,接种6孔板,每孔1×106,孵育24 h。使用Lipofectamine 2000 ,根据试剂说明书转染100 nM PTEN siRNA、miR-556-3p mimic或miRNA NC。当PTEN cDNA质粒和miR-556-3p模拟物共同转染时,首先将miR-556-3p mimic (100 nM)转染细胞。48 h后,用PTEN cDNA质粒(2 μg)和miR-556-3p mimic(100 nM)共转染细胞72 h。

1.3 细胞RNA提取和miR-556-3p检测 使用TRIzol试剂按照说明书提取总RNA。采用实时荧光定量PCR法检测mRNA相对水平。miR-556-3p引物为:5-CGGTATTGCACATTACTAAGTTGCA-3(sense),5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3(antisense);snRNA U6基因作为对照,引物为:5-ACCAGTGGCACTGTTGTTCACC-3(sense),5-TTCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3(antisense)。在美国Bio-Rad iQ5 Real-time PCR仪上使用Real-time PCR Mixture Reagent (BIO-RAD)进行PCR检测。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对水平。

1.4 细胞蛋白表达检测 采用Western Blotting法,收集细胞,并用PBS重悬,经2000 r/m离心5 min,在RIPA冷裂解液中裂解30 min。再12000 r/m离心10 min,收集上清液,用等量分光光度法测定蛋白浓度,经10% SDS-PAGE凝胶分离,转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶/TBST在室温下封闭1 h。加入抗PTEN、抗β-actin、抗p-AKT和抗AKT一抗在4℃下孵育过夜。加入合适的酶标二抗室温孵育1 h。加入HRP底物ECL,在凝胶系统成像。

1.5 细胞存活实验分析 使用细胞计数试剂盒CCK-8检测细胞存活情况。取细胞(1×105)在96孔微孔板中培养24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL,孵育1 h,在450 nm处测定吸光度。

1.6 细胞侵袭实验 使用Matrigel胶包被Transwell小室后,调整细胞数至5×104个/ml。取细胞悬液0.5 mL,加入Transwell小室内,在细胞培养箱中培养24 h。取出小室,将上室细胞擦净,并用PBS洗涤,使用预冷的甲醇固定下室细胞30 min,采用结晶紫染色10 min,显微镜下取6个视野计算下室细胞数。

1.7 细胞凋亡分析 用miR-556-3p mimic、miR-556-3p NC、PTEN cDNA和PTEN siRNA转染细胞。在转染后48 h,用Alexa Fluor 488 annexin V/Dead Cell apoptosis Kit按照说明书进行凋亡检测。细胞悬液(100 μl)与annexin V 5 μl和PI 1 μl在室温下孵育15 min。使用BD LSR II流式细胞仪对染色细胞进行分析。

1.8 荧光素酶活性分析 通过Target scan工具网站得到miR-556-3p和PTEN的结合位点。将PTEN的3’-UTR片段插入荧光素酶终止密码子下游的pGL3载体。使用快速定点诱变试剂盒生成突变型(mut-) PTEN。用萤火虫荧光素酶的报告载体0.4 μg和海肾荧光素酶pRLTK对照载体0.08 μg,以及添加或不添加miR-556-3p mimic 0.5 μg,共转染细胞。采用双荧光素酶法连续测定萤火虫和海肾荧光素酶活性。

1.9 组织PTEN表达检测 采用免疫组化法检测,取癌组织和癌旁肝组织石蜡切片,脱蜡。使用柠檬酸钠溶液修复抗原。用3%H2O2除去内源性过氧化物酶,用山羊血清封闭非特异性位点。加入抗PTEN单克隆抗体在4℃孵育过夜。次日,用PBS冲洗3次,用生物素标记的第二抗体孵育15 min,再加入DAB染色30 s。然后,用苏木精复染1 min,乙醇梯度脱水、干燥后,用中性树脂密封。

2 结果

2.1 细胞和组织miR-556-3p和PTEN水平变化 与LO2细胞比,HepG2 miR-556-3p水平显著降低(图1A);另外,经qRT-PCR和免疫组化检测结果显示,与癌旁组织比,miR-556-3p在HCC组织中表达下调,PTEN在HCC组织中表达上调(图1B、图1C)。这些结果提示miR-556-3p与PTEN可能在HCC发病机制中发挥重要作用。

2.2 不同方式转染的HepG2细胞荧光素酶活性比较 应用TargetScan分析miR-556-3p的靶向基因,PTEN mRNA序列的3’-UTR包含两个推测的miR-556-3p结合位点 (图2A)。将miR-556-3p可能的结合位点分别克隆到pGL3载体中,验证miR-556-3p在HepG2细胞靶向作用PTEN。与阴性对照比,miR-556-3p mimic和pGL3-wt 3’-UTR载体共转染HepG2细胞荧光素酶活性显著降低(图2B)。

图2 PTEN是miR-556-3p的直接作用靶点

2.3 过表达miR-556-3p和抑制PTEN对肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用情况 侵袭实验结果发现,与miR NC组比,过表达miR-556-3p可显著抑制HepG2细胞的侵袭能力(图3A/B);在48 h、72 h和96 h,与miR NC组比,过表达miR-556-3p显著抑制HepG2细胞增殖(图3C);流式细胞术检测结果发现,与miR NC组比,HepG2细胞过表达miR-556-3p显著增加了细胞凋亡(图3D)。

2.4 miR-556-3p通过靶向调控PTEN抑制AKT信号激活 蛋白免疫印迹检测显示,过表达miR-556-3p抑制AKT磷酸化和PTEN表达,这些效应被PTEN过表达所逆转(图4)。结果表明,miR-556-3p通过靶向作用PTEN,抑制AKT的激活。

图4 miR-556-3p靶向调控PTEN/AKT信号通路

3 讨论

在本研究中,我们发现与正常肝细胞系LO2相比,miR-556-3p水平在HepG2细胞显著降低,在HCC癌组织中与匹配的非癌肝组织相比也显著降低。我们的研究结果还表明,过表达miR-556-3p可显著抑制肝癌细胞增殖、侵袭,并诱导细胞凋亡。这些结果提示miR-556-3p可能在HCC发生发展过程中起抑癌作用。因此,本研究结果提示,miR-556-3p是一种肿瘤抑制miRNA,通过靶向作用PTEN/AKT抑制肝癌细胞生长。

虽然我们发现miR-556-3p具有抑癌作用,但miR-556-3p在HepG2细胞的作用机制尚不清楚。为了探索miR-556-3p在HCC发生发展过程中的分子作用机制,我们应用生物信息学算法Target Scan分析靶基因,结果发现miR-556-3p可以靶向作用PTEN。PTEN是一个单次跨膜蛋白,由582个氨基酸组成[14]。PTEN过表达常见于黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和食管癌。PTEN能抑制癌细胞凋亡,增加癌细胞的侵袭和转移能力[15]。许多信号通路都受PTEN调控,如NF-κB、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、PI3K/AKT等[16]。之前的研究指出,在HCC患者,还发现PTEN表达升高。PTEN在HCC组织表达与肿瘤微血管浸润、肿瘤分级和分期、复发率高相关[17,18]。在HCC组织或细胞,PTEN过表达通过增强PI3K/AKT、MAPK和Wnt/β-catenin信号通路等多种信号通路途径,加快肿瘤细胞生长。

在我们的研究中,HepG2细胞过表达miR-556-3p可显著下调PTEN蛋白表达。荧光素酶活性检测表明,miR-556-3p可直接结合HepG2细胞PTEN。相关性分析显示PTEN水平与HCC组织miR-556-3p呈反向相关。miR-556-3p可有效提高PTEN蛋白表达,与PTEN蛋白表达降低有关。这些结果表明,miR-556-3p可能通过调控PTEN表达而起到抑癌作用。我们的研究结果首次表明,miR-556-3p至少部分通过抑制PTEN在HCC组织细胞表达而发挥抑癌作用。