清心通络方通过调控Nrf2/HO-1通路改善小鼠心肌缺血再灌注损伤*

陈 梦 杨梦灵 董亚兰 胡德胜

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科,武汉 430022

缺血性心脏病已成为世界范围内最常见的死因之一,其主要治疗方法是通过再灌注恢复缺血心肌血运,从而改善缺血性心脏病的预后。然而再灌注会造成心肌额外损伤,称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)[1]。它发生的病理机制主要与线粒体损伤、钙超载、氧化应激和炎症反应等相关[2]。目前有关MIRI治疗的研究仍是热点。

核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是内源性抗氧化应激的关键因子,可激活下游多种抗氧化酶,如醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等,并通过多种途径协同清除再灌注时心肌组织产生的大量超氧阴离子、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)等活性氧(reactive oxygen species,ROS)成分而减轻缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤[3]。

清心通络方由黄芩、黄连、黄芩、姜黄、丹参、川芎组成,以清热解毒、活血化瘀为治则。中医认为“瘀毒”是冠心病的重要病因病机,在冠心病发病过程中,“瘀”为常,“毒”为变,因瘀致毒,瘀毒互结,从而导致恶性心血管事件的发生,因此解毒活血是冠心病瘀毒证的主要治法[4]。I/R损伤时心肌局部产生大量ROS、炎症因子,以及内皮功能障碍的病理表现与“瘀”“毒”相关。基于此,本研究探讨清心通络方改善小鼠MIRI的机制,以期为中医治疗I/R损伤提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠45只,8周龄,体重22～24 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司湖北分公司,动物许可证号:SCXK(鄂)2022-0030。造模前小鼠适应性喂养于华中科技大学同济医学院SPF级标准动物房中,标准饲料喂养,自由进食、饮水。

1.2 实验药物

中药清心通络方:黄芪15 g,黄芩10 g,黄连5 g,丹参15 g,川芎10 g,姜黄10 g。根据《药理实验方法学》换算成小鼠给药剂量(黄芪3.7 g,黄芩2.5 g,黄连1.2 g,丹参3.7 g,川芎2.5 g,姜黄2.5 g)。上述中药饮片均购于华中科技大学同济医学院附属协和医院中药房。所有药材加水慢煎,制成生药浓度为5.4 g·mL-1的液体,置于4℃冰箱冷藏,用于动物实验。另外再取1份药材制成冻干粉用于细胞实验,置于-80℃保存,临用前用DMEM培养基制成1 mg·mL-1的溶液。

1.3 主要试剂

伊文思蓝购自Sigma-Aldrich公司(货号E2129)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)购自武汉塞维尔生物科技有限公司(货号G1017);血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,货号分别为A032-1-1、E006-1-1、A020-2-2、C010-2-1、A001-3-2、A003-1-2;RNA逆转录与扩增试剂盒购自武汉擎科生物技术有限公司(货号TSK301M、TSE201);细胞凋亡试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司(货号AP104);Bax、Bcl-2抗体购自Abmark公司(货号TU333334S、TU323153S),PARP-1、α-actin抗体购自proteintech公司(货号23660-1-AP、66520-1-Ig),HO-1、Nrf2抗体购自ABclonal公司(货号A1244、A1346)。

1.4 主要仪器

小动物呼吸机(上海奥尔科特生物技术有限公司,型号ALC-V8S);体式显微镜(日本OLYMPUS,型号SZX2-ZB10);多功能酶标仪(美国PerkinElmer,型号EnSpire);离心机(德国Eppendorf,型号Centrifuge 5424R);匀浆机(武汉赛维尔生物科技有限公司,型号KZ-Ⅱ);实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD,型号CFX ConnectTM);电泳仪(美国BIO-RAD,型号PowerPacTMBasic);凝胶成像仪(美国赛默飞,型号iBright750)

1.5 动物分组和给药

将45只雄性小鼠随机分为假手术组、模型组和中药组,每组15只。适应性喂养1周后,中药组给予1.08 g·kg-1·d-1的清心通络方灌胃,假手术组和模型组则予等体积生理盐水(0.2 mL·d-1)灌胃,每日固定给药1次。给药14 d后造模。中药剂量根据《药理实验方法学》进行换算。

1.6 小鼠心肌I/R模型的建立

参照常规方法:结扎小鼠左侧冠状动脉左前降支造成左心室缺血,以心电图出现ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功的标准,显微镜下见心肌组织泛白,30 min后松开结扎线恢复冠脉血液。

1.7 小鼠血清及心脏组织样本提取

运用眼眶采血及摘除眼球的方法分别获得I/R 6 h和I/R 1 d的血液样本,于4℃、3500 rpm离心10 min后获取血清,并再次4℃、12000 rpm离心10 min后取上清,置于-80℃冻存,等待检测相关指标。采取颈椎脱臼法处死小鼠,取左心室心肌组织进行匀浆后分别提取RNA及蛋白用于qPCR及WB检测。

1.8 检测指标及方法

1.8.1 小鼠一般情况评估 观察各组小鼠一般情况,包括精神、活动、饮食、皮毛光泽度、大小便等,称重记录造模前后各组小鼠体重变化。

1.8.2 心肌梗死面积的测定 I/R 3 d后在原位重新结扎冠脉左前降支,经股静脉注入3%伊文思蓝染料,待小鼠口唇变蓝后取出心脏,用最佳切削温度(optimal cutting temperature,OCT)化合物包埋固定后沿心脏水平面自心底向心尖平均切成薄片,随后置于1% TTC中37 ℃避光孵育30 min,用4%多聚甲醛溶液固定24 h后拍照。正常心肌呈蓝色,缺血心肌呈红色,梗死心肌呈白色。心梗面积百分比=[各切片白色梗死区域之和/(各切片白色梗死区域之和+各切片红色缺血区域之和)]×100%。

1.8.3 血清CK、CK-MB、LDH、AST水平测定 取各组小鼠I/R 6 h后的血清,按照检测试剂盒操作说明测定CK、CK-MB、LDH、AST的水平。

1.8.4 血清MDA含量及SOD水平测定 取各组小鼠I/R 1 d后的血清,按照检测试剂盒操作说明进行测定。

1.8.5 qPCR检测心肌组织IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA相对水平 取I/R 1 d的小鼠左室区域心肌组织,匀浆后提取总RNA,逆转录后进行qPCR,检测IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA相对表达水平。

1.8.6 WB检测心肌组织Bax、Bcl-2、PARP-1、HO-1、Nrf2的蛋白表达水平 分别取I/R 1 d和I/R 3 d的小鼠左室区域心肌组织,匀浆后提取总蛋白,用BCA法测定总蛋白浓度,绘制标准曲线,确定上样量。电泳及转膜完成后,用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,用抗体稀释液按1∶1000稀释一抗Bax、Bcl-2、PARP-1、HO-1、Nrf2、α-actin后于4℃摇床孵育过夜;按1∶3000稀释二抗,于37 ℃孵育2 h。用ECL发光液及显影液处理膜后曝光获得WB图片。

1.8.7 HL-1细胞凋亡检测 分为正常组、模型组、低浓度(0.1 mg·mL-1)中药组和高浓度(0.25 mg·mL-1)中药组,中药组先予以不同浓度中药预处理HL-1细胞24 h,模型组、低浓度中药组和高浓度中药组用200μM H2O2处理6 h,最后按细胞凋亡试剂盒的操作说明检测各组细胞凋亡水平。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 清心通络方对小鼠体重的影响

给药周期内各组小鼠一般情况可,体重均有所增长。给药结束后,与假手术组和模型组相比,中药组小鼠体重变化差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠体重变化

2.2 清心通络方对小鼠心梗面积的影响

模型组及中药组小鼠心脏切片双染后均可见白色梗死区域和红色缺血区域,每组取1只小鼠心脏不同水平切面展示,从心尖部位至心室部位共选4个切面,见图1。

Ⅰ:模型组;Ⅱ:中药组。

与模型组比较,中药组小鼠心梗面积显著减少(P<0.01),见表2。

表2 MIRI小鼠心梗面积比较

2.3 清心通络方对小鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST的影响

与假手术组相比,模型组小鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST水平显著增加(P均<0.01);与模型组相比,中药组小鼠血清CK、LDH、AST水平均下降(P<0.01或P<0.05),CK-MB水平下降但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST水平变化

2.4 清心通络方对小鼠心肌炎症因子mRNA水平的影响

与假手术组相比,模型组小鼠心肌组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平明显升高(P均<0.01);与模型组相比,中药组小鼠心肌组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平明显降低(P均<0.01)。见表4。

表4 各组小鼠心肌IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相对含量变化

2.5 清心通络方对小鼠血清SOD、MDA的影响

与假手术组相比,模型组小鼠血清SOD水平降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.01);与模型组相比,中药组小鼠血清MDA含量明显下降(P<0.01),SOD水平显著升高(P<0.01)。见表5。

表5 各组小鼠血清中SOD、MDA水平变化

2.6 清心通络方对小鼠心肌PARP-1、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响

与假手术组相比,模型组小鼠心肌组织中PARP-1、Bax蛋白表达量升高(P均<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表达量下降(P均<0.01);与模型组相比,中药组小鼠心肌组织中PARP-1、Bax蛋白表达量明显下降(P均<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表达升高(P均<0.05)。见图2及表6。

A:假手术组;B:模型组;C:中药组。

表6 各组小鼠心肌织中PARP-1、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白相对表达

2.7 清心通络方对H2O2 处理后HL-1细胞凋亡的影响

与正常组相比,H2O2处理后模型组HL-1细胞凋亡明显增加(P<0.01),中药组HL-1细胞凋亡减少(P<0.01),但低剂量中药组与高剂量中药组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 各组HL-1细胞凋亡结果比较

3 讨论

MIRI可归于中医学“胸痹”“真心痛”等范畴。心主血脉,其五行属火,故火热之邪最易入心,如《圣济总录》云:“大抵心属火而恶热,其受病则易以生热”。火为热之极,毒为火之聚,内生火热毒邪煎灼脉道,伤其形,败其血,遂致血脉失和,变证丛生[5]。正如《素问·刺热篇》言:“心热病者,先不乐,数日乃热,热争则卒心痛”。且“瘀毒”与血管内皮损伤、炎症反应、细胞凋亡和氧化应激相关[6]。针对“瘀毒”,清热解毒可降低“热毒负荷”,而活血可扩张冠脉、抗血小板黏附、改善微循环[7-8]。清心通络方由黄芪、丹参、川芎、姜黄、黄芩、黄连组成,其中丹参活血祛瘀、清心除烦,川芎活血行气、姜黄破血行气、黄芪补气行血,三者加强丹参之活血祛瘀;黄连、黄芩性味苦寒,能清热解毒;全方共奏清热解毒、活血化瘀之效。现代药理学研究表明,川芎能镇痛、抗炎、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、改善心功能等[9]。川芎提取物在盐酸异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌缺血损伤模型和大鼠心肌I/R损伤模型中均能增加血清SOD的含量、减少MDA含量,通过抗氧化改善缺血心肌损伤[10-11]。姜黄能抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗纤维化及保护神经细胞等[12]。其有效成分姜黄素可通过抑制氧化应激、抑制炎症反应、抑制凋亡等途径减轻MIRI[13]。丹参活性成分能多方面抗MIRI,包括清除氧自自由基、抑制心肌细胞钙超载、改善能量代谢、抑制炎症反应、抗血小板聚集、调节血管内皮功能及促进微血管再生等[14]。丹参及其配伍制剂均能治疗冠心病,保护心脏[15]。此外,临床研究发现丹参川芎嗪在室间隔缺损修补术中应用于体外循环时,可明显降低MDA、升高SOD,从而发挥保护心肌和抗心律失常的作用[16]。黄芪具有抗炎、抗氧化应激、抗纤维化、促进血管生成等作用,能有效减轻缺血再灌注损伤[17];其活性成分黄芪甲苷和丹参有效成分——丹参素联用能在大鼠心肌缺血晚期发挥保护心肌及改善心功能的作用,可能与调控缺血心肌糖脂代谢、抗炎、抗心肌纤维化等作用有关[18]。黄芩的药理作用主要包括抗炎、抗氧化、抗免疫等[19];研究发现其有效成分黄芩苷通过MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB信号通路调节心脏氧化应激与炎症,从而减轻大鼠MIRI[20]。黄连最主要的有效成分小檗碱在心血管系统中具有抗心律失常、抗心力衰竭、抗血小板聚集、抗高血压等药理作用[21];它可通过降低MIRI时的心肌过氧化抑制心肌细胞凋亡[22]。本研究结果与前述研究相似,方中诸药配伍,能改善MIRI,并通过增强抗炎、抗氧化的作用保护心肌。

再灌注治疗仍是目前急性心梗的主要治疗方案,而有效减轻MIRI能进一步改善缺血性心脏病的最终预后。氧化应激和炎症反应均是导致MIRI的重要机制。目前有关MIRI氧化应激的机制研究主要涉及Nrf2/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)、PI3K/Akt-eNOS和线粒体参与[23]。其中Nrf2/ARE信号通路功能强大,它庞大的转录网络是Nrf2能够多方面维持内部环境稳定的基础。Nrf2具有氧化还原、促进代谢和维持蛋白质稳态及缓解炎症的生理作用,它的激活剂已在许多人类疾病模型中显示出保护作用,被认为是一种药物靶点[24]。在非应激状态下,E3泛素连接酶通过kelch样ECH相关蛋白1(kelch like ECH associated protein 1,Keap1)靶向Nrf2使其降解;而在应激状态下,多种蛋白通过Keap1激活Nrf2使其入核与ARE结合,激活下游抗氧化基因如HMOX1、GPX2、NQO1的转录,抑制IL-1β、IL-6等促炎基因的表达,从而发挥Nrf2抗氧化、抗炎等多种生物功能[25]。Hao T等基于MIRI时ROS与NO失衡的病理改变合成具有逆转ROS/NO失衡功效的药物CS-B-NO,该药物发挥抗MIRI作用的主要机制是激活Nrf2/Keap1信号通路,增加SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶的含量,在抗氧化应激的同时抑制NF-κB信号通路减轻炎症反应[26]。

本研究结果显示,清心通络方能有效减少心肌细胞凋亡及心梗面积,提高小鼠血清抗氧化酶SOD活性、降低MDA含量,并提高Nrf2及HO-1的蛋白表达,提示其对MIRI小鼠具有显著的抗氧化损伤作用。同时,用药后心肌损伤炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平明显下降,表明其具有抗炎功效。综上所述,清心通络方能够改善小鼠MIRI,其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1通路、抗氧化应激、抗心肌细胞凋亡等途径发挥药理作用。