基于网络药理学探讨健脾益肾化浊方治疗多囊卵巢综合征的作用机制*

李玲义，冯亚宏，张晓静，马梅香

1 甘肃中医药大学 甘肃兰州 730030

2 宁夏回族自治区中医医院暨中医研究院 宁夏银川 750021

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是发生在青少年女性及育龄期妇女的一组症候群，以高雄激素、排卵障碍、卵巢多囊样改变为特征[1]。其中医病因病机关及到肝脾肾等多脏腑，西医具体病理机制至今仍不十分清楚。近期临床表现主要为稀发排卵或无排卵引起的月经后错，甚至闭经、不孕，伴有不同程度的高雄激素血症（肥胖、多毛、痤疮、黑棘皮症）以及糖脂代谢紊乱（肥胖、血脂血糖异常）；远期影响主要为长期的血糖、血脂代谢障碍而出现糖尿病、高血压、心脑血管疾病等继发疾病，持续偏高的雌激素水平还可导致子宫内膜癌、乳腺癌的发生。

健脾益肾化浊方是宁夏回族自治区中医医院暨中医研究院妇科名家王淑斌主任及导师冯亚宏主任根据多年临床经验，沿袭经方二仙汤、苍附导痰丸和四君子汤化裁而成，方中以黄芪、党参健脾益气，仙茅、淫羊藿补肾壮阳助气化，同时温化脾阳，四药合为君药；白术益气健脾以利水，茯苓健脾利水以渗湿，菟丝子、桑寄生补肾益气，为臣药；苍术、荷叶健脾化湿，香附行三焦之气，并引诸药入肝经，陈皮行气调中，燥湿化痰，为佐药[2]。在临床跟师学习过程中总结，发现老师在临床诊治肥胖型PCOS 从“脾肾两虚、痰湿内聚”立论，以“健脾益肾、化痰祛浊”为法，治疗PCOS疗效颇佳。课题组前期临床观察已证实[3]，此方治疗PCOS 疗效可观，动物实验进一步验证健脾益肾化浊方治疗PCOS 的作用机制可能是通过抑制NLRP3 炎症小体的激活，减少卵巢组织中炎性因子的释放，有效减轻 PCOS 炎症状态，改善卵巢功能，调节生殖内分泌水平[4]，笔者想通过网络药理学进一步探讨其他作用机制。

现临床上中医药因可选择性大、灵活多样而成为治疗多囊的更优选择，2018 年《多囊卵巢综合征中国诊疗指南》[5]首次将中医治疗写入PCOS 患者治疗指南当中，这也说明中医治疗PCOS 确实有效。但中医药活性成分复杂，作用机制不明确，阐明中药药理作用和分子机制仍存在一定困难。网络药理学是一门多学科、多中心综合的新型学科，能够对中药活性成分、作用靶点及作用机制进行预测分析，为中医药现代化提供理论依据，有利于中医药在临床治疗过程中的科学化。因此，本研究想通过网络药理学，探讨健脾益肾化浊方治疗PCOS 的可能机制，以冀为临床中医药治疗PCOS 提供理论依据。现将研究结果总结如下。

资料与方法

1 健脾益肾化浊方活性成分的筛选及有效成分对应靶点的筛选

通过TCMSP 数据库[6]：以黄芪、白术、党参、茯苓、淫羊藿、仙茅、菟丝子、桑寄生、陈皮、苍术、荷叶、香附12 味中药为关键词，检索各中药的活性成分。由于中药成分复杂多样，组方药物较多，故需要对中药成分进行条件筛选，生物利用度（OB）和类药性（DL）是网络药理学中药活性成分筛选的重要影响因素，因此，选取同时满足OB ≥30%、DL ≥0.18 筛选该方的活性成分。进一步筛选各活性成分的作用靶点，去除无明确作用靶点的活性成分。应用Uniport 蛋白数据库对各中药的作用靶点进行人类蛋白基因匹配。

2 PCOS 相关靶点的筛选

通 过Gene Cards 数 据 库[7]：以“polycystic ovary syndrome or PCOS”为关键词检索与PCOS 相关的疾病蛋白。

3 健脾益肾化浊方与PCOS 交集靶基因的筛选及相互关系（PPI）网络的构建

通过venny2.1.0 对组方潜在活性成分靶基因和PCOS 相关靶基因制作韦恩图。用excel 数据处理中药与疾病的交集基因。将交集基因导入String 数据库，构建PPI 网络图，设置基因来源为人类，置信度为0.9。对String 数据库中的TSV 文件导入Cytoscape3.9.0 进行可视化分析。

4 交集靶基因的GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

将组方靶基因和PCOS 相关靶基因的交集基因通过Meta scape 数据库进行GO 功能富集和KEGG 信号通路分析并利用微生信作图将结果可视化分析。

结 果

1 健脾益肾化浊方活性成分的筛选及有效成分对应靶点的筛选

通过TCMSP 数据库进行检索，筛选健脾益肾化浊方活性成分122 种，其中黄芪17 种，白术4 种，党参16 种，茯苓6 种，淫羊藿23 种，仙茅6 种，菟丝子9种，桑寄生2 种，陈皮5 种，苍术4 种，荷叶14 种，香附16 种，通过Cytoscape3.9.0 软件构建活性成分网络图，见图1。对有明确作用的靶点通过Uniport 蛋白数据库进行人类蛋白匹配后导入Cytoscape3.9.0 软件构建中药-活性成分-基因靶点网络图，见图2。

图1 组方活性成分网络

图2 中药-活性成分-基因靶点网络

2 健脾益肾化浊方与PCOS 交集靶基因的筛选及相互关系（PPI）网络的构建

检索Gene Cards 数据库中PCOS 相关疾病基因1297 个，与组方活性成分靶基因254 个，通过venny2.1.0 在线工具制作韦恩图，见图3。再通过excel 数据处理，取中药组方与疾病的交集基因。将交集基因导入String 数据库，构建PPI 网络图，见图4。设置置信度0.9，其余设置均为默认设置，PPI 分析：有116 个节点，451 条线，平均节点的度值7.78，平均局部聚类系数0.44。点的连接条数越多表示关联越大。将交集基因String 数据库中的TSV 文件导入Cytoscape3.9.0，利用插件Cyto NCA 进行可视化分析，结果见图5。图中每个颜色代表一个基因靶点，节点颜色表示度值，度值越大，颜色越深，由黄到绿，图标也越大。图中显示健脾益肾化浊方治疗PCOS 排在前十位的靶点有MAPK1、MAPK3、AKT1、TP53、TNF、MAPK14、IL6、ESR1、EGRF、RB1，这些靶点可能是治疗PCOS 的关键基因。

图3 疾病靶点Venn

图4 PPI 网络

3 交集靶基因的GO 富集分析

通过Meta scape 数据库：对健脾益肾化浊方治疗PCOS 的交集靶点进行GO 富集分析，包括生物过程、细胞成分和分子功能3 个方面的分析。将从数据库下载的GO.csv 文件通过excel 进行处理，分别选取前20 位GO 条目，结果显示健脾益肾化浊方治疗PCOS主要靶点的生物过程（BP）主要富集在激素、脂质细胞、无机物质、外来刺激、类固醇激素脂多糖、细胞凋亡、细胞群体增殖、代谢和分解过程等的调控；细胞组成（CC）主要富集在内质网膜、膜蛋白、滑面内质网、细胞外基质、细胞质等；分子功能（MF）主要富集在蛋白质结合、酶结合、生长因子结合、细胞因子活性、MAP 激酶活性、肿瘤坏死因子等。再借助微生信在线网站作GO 富集BP、CC、MF 三合一图，见图6。

图6 GO 富集BP、CC、MF

4 交集靶基因的KEGG 富集分析

通过Meta scape 数据库：对健脾益肾化浊方治疗PCOS 的交集靶点进行KEGG 富集分析，将下载的KEGG.csv 文件通过excel 进行处理，选取前20 位为主要信号通路如癌症通路、AGE-RAGE 信号通路、雌激素信号通路、IL-18、IL-13、IL-4 信号通路、PI3KAkt 信号通路、细胞因子信号通路等，见表1。再借助微生信在线网站作KEGG 富集气泡图，见图7。

表1 KEGG 通路富集分析结果

图7 KEGG 富集气泡

讨 论

PCOS 作为一种高度异质性疾病，发病率正在呈逐年增长的趋势，西医具体病理机制至今仍不十分清楚。但目前临床公认其发病与胰岛素抵抗、糖脂代谢异常、高雄激素有关，且高糖高脂-胰岛素抵抗-高雄激素之间是一个恶性循环的过程。长期高糖高脂可导致胰岛素抵抗，当发生胰岛素抵抗时，卵巢分泌雄激素增多，导致血液中雄激素增加，生成高雄激素血症，而升高的雄激素反过来又能导致高胰岛素血症[8]。有文献表明，PCOS 妇女中发生糖代谢异常率为24.5%[9]，血脂异常发生率为24.7%[9]，高雄激素占PCOS 患者的75%[10]，胰岛素抵抗发生率占肥胖PCOS的75%[11]。临床西医治疗主要为改善生活方式、调节饮食结构、降雄、改善胰岛素抵抗、降糖降脂等对症治疗[12]。中医对其治疗主要包括分型论治、中成药、周期疗法、针灸治疗等[13]。

本研究通过对健脾益肾化浊方治疗PCOS 进行网络药理学分析，主要从组方的活性成分、作用靶点、信号通路等方面进行探讨，得到健脾益肾化浊方的潜在活性成分有槲皮素、山奈酚、植物甾醇、木犀草素、异鼠李素等，可能通过丝裂原活化蛋白激酶受体（MAPK1、MAPK3、MAPK14）、蛋白激酶（AKT1）、白介素受体（IL-6）、肿瘤抑制因子（TP53）、肿瘤坏死因子（TNF）、雌激素受体（ESR1）等多靶点，可以作用于AGE-RAGE 信号通路、雌激素信号通路、炎症信号通路、PI3K-Akt 信号通路、癌症通路、细胞因子信号通路等多通路发挥治疗PCOS 的作用。

首先，从TCMSP 数据库筛选后，健脾益肾化浊方的潜在活性成分主要有槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、植物甾醇（MOL000359）等，组方共同活性成分结果，见表2。

表2 组方共同成分

健脾益肾化浊方的潜在活性成分可能发挥的治疗作用分析如下：槲皮素是一种黄酮类化合物，它可能具有抗炎和抗氧化特性[14]。王针织通过动物实验证实[15]，槲皮素可能通过抑制TLR/NF-κB 信号通路，改善多囊卵巢胰岛素抵抗微环境炎症，从而逆转胰岛素抵抗。有文献进一步表述[16]，槲皮素有上述作用。因此，槲皮素是一个潜在的，对胰岛素抵抗有较好治疗效果的药物。山奈酚也是一种广泛存在于自然界的黄酮类化合物[17]，其生物活性主要为抗炎、抗氧化以及抗癌[18]。植物甾醇及其衍生物具有降血糖、调血脂、降胆固醇、抗肿瘤、抗炎、抗氧化和预防心血管疾病等生理活性[19]，而糖脂代谢紊乱是PCOS 重要的病理改变。木犀草素也是黄酮类化合物，具有抗氧化，抗炎，抗糖尿病等作用，可以通过调控PI3K/Akt 通路抑制IR[20]。综上所述，健脾益肾化浊方中筛选出来的潜在活性成分可通过调节糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、卵泡发育等发挥治疗PCOS 的作用。

另外，PCOS 患者因糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、高雄激素血症，机体长期处于慢性炎症或氧化应激状态[21]。从关键靶点分析，IL-6 是人体多种细胞分泌的一种多肽物质，作用于机体免疫、内分泌和心血管等多系统，是参与机体各种调节的重要因子。首先，IL-6 作为一种炎症标志物，在PCOS 的发病过程中有着多方面影响[22]。另外，PCOS 患者的血清IL-6 水平与糖脂代谢有关[23]，血清IL-6 水平与BMI 呈正相关，且IL-6 主要与IR 有关[24]。MAPK 是一类进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，能将细胞外刺激转化为广泛的细胞反应从而参与增殖、分化、迁移、凋亡等多种细胞功能[25]。本研究显示，MAPK1、MAPK3、MAPK14 都是排在前十位的关键靶点，MAPK3 又叫细胞外信号调节激酶1（ERK1），ERK1 和ERK2 在 功 能 上 相 似[26]；MAPK14 是MAPK家族中最丰富，最具特征的重要成员，在多种肿瘤中高度表达，如乳腺癌、卵巢癌[27]。

KEGG 富集分析显示，AGE-RAGE 信号通路、雌激素信号通路和PI3K-Akt 信号通路是健脾益肾化浊方发挥治疗PCOS 的主要通路，其中AGE-RAGE 信号通路和PI3K-Akt 信号通路均与胰岛素抵抗有关。研究表明，大约50%～70%患有PCOS 的女性有一定程度的胰岛素抵抗[28]。PI3K-Akt 作为胰岛素信号转导的主要通路，具有调节控制机体中的葡萄糖吸收、糖原降解和合成的作用，增强PI3K/Akt 信号通路的表达可减轻胰岛素抵抗。AGE-RAGE 信号通路是一个和糖尿病（DM）及其并发症联系相当密切的通路[29]，AGEs 为糖基化终末产物（advanced glycosylation end products），RAGE 属于细胞表面免疫球蛋白超家族多配体受体成员，若两者结合，可以激活并促进炎性反应、氧化应激，最终导致IR 及DM 其他并发症的发生[29]。本研究结果得出的关键靶点在内分泌拮抗通路上显著富集，表明健脾益肾化浊方可通过多靶点调节PCOS 患者内分泌稳态从而发挥治疗作用。

综上所述，推测健脾益肾化浊方的活性成分、关键靶点、信号通路可能以“多成分-多靶点-多通路”调节糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、卵泡发育等方面发挥治疗PCOS 的作用。后续本课题组将对其活性成分及具体机制进行深入探讨，以期为健脾益肾化浊方在临床治疗中的辨证用药提供科学依据。