金鸡胶囊治疗盆腔炎的活性成分和作用机制预测*

王严严，蒋世云

1 广西科技大学生物与化学工程学院 广西柳州 545006

2 广西科技大学医学部 广西柳州 545006

盆腔炎（pelvic inflammatory disease，PID）是临床上常见的妇科疾病，其主要由微生物感染引起的炎症反应，可导致不孕症、异位妊娠和慢性盆腔疼痛等后遗症，严重影响女性健康[1]。临床上常采用广谱抗生素治疗，但是长期使用抗生素容易引起胃肠道反应、耐药性等不良反应[2]。金鸡胶囊（JinJi JiaoNang，JJJN）是在金鸡冲服制剂的基础上，更改技术工艺，是广西灵峰药业有限公司在国内首创研发出的妇科用药。由于中药制剂成分较多且复杂，金鸡胶囊所起疗效的主要活性成分和作用机制还不是十分清楚。故本文运用网络药理学和分子对接技术，通过构建金鸡胶囊活性成分-作用靶点-通路网络关系图，得到关键活性成分和核心靶点，初步阐明金鸡胶囊治疗PID 的作用机制，为后续增强其疗效提供一定的科学依据。

资料与方法

1 金鸡胶囊活性成分和靶点的搜集与筛选

基 于 数 据 库ETCM[3]、HERB[4]、TCMSP[5]和 文献[6]搜集金鸡胶囊6 味中药所有化学成分。以OB ≥30%，DL ≥0.18[7]和Lipinski 规则[8]作为药物活性成分的筛选条件建立金鸡胶囊药物活性小分子库。基于Pubchem 数据库[9]和SwissTargetPrediction数据库[10]预测化合物作用靶点。

2 PID 疾病靶点的筛选

以关键词“pelvic inflammatory disease”上传至OMIM 数 据 库（https：//www.omim.org/）、Genecards 数据库（https：//www.genecards.org/）进行检索，两者合并去重复得到盆腔炎（PID）疾病作用靶点。

3 金鸡胶囊治疗PID 靶点蛋白相互作用分析

利用BioLadder 生物信息在线分析可视化云平台（https：//www.bioladder.cn/web/#/pro/index） 分 析金鸡胶囊化学成分作用靶点和PID 疾病作用靶点，得到交集靶点。利用String 数据库（https：//www.string-db.org/）初步分析蛋白之间的相互作用，并运用Cytoscape 3.8.2 软件对得到的tsv 格式进一步分析，结合Network Analyzer 分析得到的度值大小排序和插件Cytohubba 中的MCC 算法得到的分数排名较高的前30 位靶蛋白，取共同靶蛋白作为潜在的核心靶点进行后续的研究[11]。

4 核心靶蛋白的基因富集分析

运用Cytoscape 3.8.2 软件中的插件ClueGo[12]和Metescape 数据库[13]对核心靶点进行基因本体分析，物种选择人类，P＜0.01，分析其主要的生物学过程和作用通路。通过构建金鸡胶囊活性成分-核心靶点-关键通路图，经Network Analyzer 分析后根据度值、介数中心性和紧密性＞中位数反推测出起主要作用的药物成分和作用靶点，进一步从整体出发，探究金鸡胶囊治疗PID 的作用机制和活性成分。

5 分子对接研究

运用Autodock 4.0 软件对筛选出的5 个关键活性物质和6 个核心靶蛋白进行对接，初步验证网络药理学的准确性。利用Pubchem 数据库[9]和OpenBabel软件完成关键活性成分结构的下载和pdb 格式文件的转换，作为小分子配体。利用PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）和Uniport 数据库（https：//www.uniprot.org/）筛选并下载相应蛋白的晶体结构，作为分子对接的受体。使用AutoGrid 工具设置对接盒的参数，采用半柔性对接找到最佳对接条件，并记录受体和配体的对接位置。将对接自由能绝对值＞8.0Kcal/mol 的作为优势构象[14]，利用Pymol 软件和PLIP 数据库[15]进行可视化绘制和分析。

结 果

1 金鸡胶囊主要活性成分的筛选结果

结 合ETCM、HERB、TCMSP 数 据 库 和 文 献，共检索出金鸡胶囊化学成分有712 种。同时满足OB ≥30%、DL ≥0.18 和类药五原则（MW（g/mol）＜500、Hdon＜5、Hacc＜10、Rbon ≤10、ALogP＜5）共有46 种。其中穿心莲9 种、功劳木7 种、鸡血藤17 种、两面针15 种、千斤拔3 种、金樱根1 种，见图1 和表1。

表1 金鸡胶囊化学成分

图1 金鸡胶囊活性成分网络关系

2 金鸡胶囊化学成分作用靶点和PID 疾病靶点的筛选结果

经过SwissTargetPrediction 预测，得到金鸡胶囊复方中穿心莲、功劳木、鸡血藤、两面针、千斤拔和金樱根作用靶点数目分别为282、284、368、376、81 和57，整理后得到金鸡胶囊作用靶共618 个。对OMIM数据库和Genecards 数据库检索得到PID 疾病靶点，经去重复处理后得到510 个。利用BioLadder 在线分析，得到金鸡胶囊治疗PID 的作用靶点89 个，见图2。

图2 金鸡胶囊治疗PID 交集靶点

3 金鸡胶囊治疗PID 靶蛋白相互作用分析结果

经String 数据库对交集靶蛋白初步分析得到相互作用网络关系图，图中共涉及78 个节点、245 条边，见图3。将tsv 格式上传至Cytoscape 软件，结合Network Analyzer 分析和MCC 算法运算结果，对排名前30 名靶蛋白取交集，得到26 个交集靶蛋白，作为后续研究的核心靶蛋白，具体拓扑参数见表2。

表2 金鸡胶囊治疗PID 核心靶蛋白网络拓扑分析

图3 金鸡胶囊治疗PID 蛋白相互作用分析

4 核心靶蛋白的GO、KEGG 分析结果

从整体看，经ClueGo 插件对核心靶蛋白分析得到主要生物学过程包括细胞增殖、细胞迁移和腺体发育、对活性氧的反应、一氧化氮合酶活性的调节等，见图4。KEGG 分析得到132 条作用通路，除广泛的癌症信号通路外，主要涉及HIF-1 信号通路、PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT 信号通路和C 型凝集素受体信号通路等炎症信号通路。根据P＜0.01 和基因数量选择前20 个作用通路做可视化分析，见图5。

图4 ClueGo 功能分析核心靶点生物学过程网络关系

图5 核心靶蛋白作用通路富集分析

5 金鸡胶囊活性成分-核心靶点-关键通路的构建结果分析

利用Cytoscape 3.8.2 软件绘制“金鸡胶囊活性成分-核心靶点-关键通路图”，经Network Analyzer 分析后得到89 个节点，269 条边，活性成分的度值中位数为5.35135，靶蛋白度值中位数为15.07692。根据度值排序，金鸡胶囊中前5 个化学成分14-去氧-12-甲氧基穿心莲内酯（JJJN3）、穿心莲黄酮（JJJN5）、甘草查尔酮A（JJJN20）、远志酮I（JJJN25）和千层纸素A（JJJN2）作为主要活性成分。6 个靶蛋白EGFR、PIK3CA、ESR1、AKT1、MTOR、MAPK1 作为最核心的靶点发挥作用，见表3。

表3 金鸡胶囊主要活性成分和核心靶点拓扑参数

6 分子对接结果

利用Autodock 软件将5 个关键化合物（14- 去氧-12-甲氧基穿心莲内酯、穿心莲黄酮、甘草查尔酮A、远志酮I、千层纸素A）和6 个核心靶蛋白（EGFR、PIK3CA、ESR1、AKT1、MTOR、MAPK1）进行分子对接，对接结果以热图显示，见图6。从图中可以看出，化合物与靶蛋白结合自由能均小于零，说明两者可进行自由结合，且结合能值越低代表两者结合越牢固，结合效果越好[17]。其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心莲内酯与靶蛋白ESR1 结合自由能值最小，为-9.65Kcal/mol，说明该化合物可能是通过靶蛋白ESR1 对PID 发挥治疗作用。利用Pymol 软件和PLIP数据库分析优势构象之间的相互作用，见表4。

表4 优势构象对接结果

图6 金鸡胶囊中关键成分与核心靶点对接结果

讨 论

金鸡胶囊是妇科常用药，临床上常用于治疗湿热下注引起的PID 疾病。在该制剂中金樱根能够除湿热、止带，为君药；鸡血藤行血通络，千斤拔利湿、消瘀、解毒，功劳木、穿心莲清热解毒，共为臣药；两面针行气止痛、解毒消肿，为佐药[18]。本研究对金鸡胶囊治疗PID 的主要活性成分和作用机制进行了初步预测和分析，其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心莲内酯、穿心莲黄酮和千层纸素A 为穿心莲化学成分，甘草查尔酮A 和远志酮I 为鸡血藤化学成分，这也正说明了君臣药中所含有的化学成分可能在治疗PID 的过程中起较大作用。靶蛋白EGFR、PIK3CA、ESR1 等6 个作用靶蛋白可能为主要的作用靶点，主要作用于HIF-1信号通路等炎症信号通路发挥治疗作用。

化合物14-去氧-12-甲氧基穿心莲内酯属于半日花烷型二萜内酯类，该类化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理活性作用[19]。但是目前对此化合物的药理活性研究暂未见相关报道。结合分子对接，发现该化合物与靶蛋白ESR1 结合自由能最小，后续可在确保药物的安全性及可靠性的情况下，着重研究其药理学活性和新型靶向制剂等。研究发现，穿心莲黄酮能够强抑制血小板聚集，具有活血化瘀的作用[20]。Li MT 等[21]通过整理甘草查尔酮A 的药理活性，发现其具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗寄生虫等多种药理活性。化合物远志酮I 属于氧杂蒽酮衍生物，研究发现，基于氧杂蒽酮为母体衍生出来的化合物，具有抗肿瘤、抗凝血、抗血小板、抗炎等多种药理活性[22]。但是对于该化合物，是否具有抗炎、抗菌等功效还是有待验证。研究发现，千层纸素A 可通过抑制NO 产生和COX-2 酶的表达发挥基础抗炎作用，通过对血管舒张、抵抗血管脱落和抗血管增生发挥对血管组织和细胞的保护作用，此外还有可以保护神经细胞以及抗病毒作用[23]。

结合PPI 蛋白互作关系网络图筛选出6 个核心靶蛋白。其中靶蛋白EGFR 是一种酪氨酸激酶，参与细胞稳态的调节，影响体内细胞发育过程，以及血管生成和肿瘤的发生[24]。靶蛋白PIK3CA、AKT1、MTOR可参与PI3K/AKT/MTOR 信号通路，该信号通路参与调控体内细胞过程，包括细胞生长、凋亡、分化和迁移等[25]。研究发现，甘草查尔酮A 可以激活该信号通路，抑制肾癌细胞的生长过程，包括细胞增殖、迁移和侵袭，并可以诱导肾癌细胞发生自噬[26]。靶蛋白ESR1为雌激素受体，当与雌激素配体结合后，可释放疼痛因子和炎症因子，可导致慢性PID 疼痛[27]。MAP 激酶可作为几种生化信号通路的整合点，参与各种细胞过程，如细胞凋亡，炎症和转录调节[28]。分子对接显示六个核心靶蛋白与五个关键化合物都有一定的结合口袋，且结合自由能在-9.65Kcal/mol ～-5.56Kcal/mol。其中化合物14-去氧-12-甲氧基穿心莲内酯和甘草查尔酮 A 与靶点ESR1、AKT1 均具有较好的结合能力，能够形成稳定的复合结构，故推测这两个靶点和化合物可能在金鸡胶囊治疗PID 过程中起主要作用。

GO 富集分析表明金鸡胶囊治疗PID 参与了细胞增殖、细胞迁移和腺体发育、对活性氧的反应以及一氧化氮合酶活性的调节等生物学过程。研究发现，低至中等活性氧的浓度可通过调节细胞信号级联反应来发挥其作用，能够对生长因子的刺激做出反应以及控制炎症的发生[29]。NO 作为体内急性和慢性炎症疾病的重要调节剂之一，调节一氧化氮合酶活性是生物体内非常重要的生物过程之一[30]。KEGG 富集分析表明金鸡胶囊治疗PID 的作用机制与HIF-1 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、JAK-STAT 信号通路、C 型凝集素受体信号通路等炎症信号通路有关。结合文献[31]可知，PID 现代发病机制与炎症免疫反应、氧自由基、性激素、细胞凋亡机制和血液流变等有很大的关系。研究发现HIF-1 能够参与自身免疫疾病的发生和发展，比如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和强直性脊柱炎等[32]。其中HIF-1α 是该信号通路中的关键靶基因，在缺氧状态下能够广泛的存在机体内，研究发现该基因均可在免疫性炎症疾病中、细菌性和病毒性感染和脂多糖诱导的巨噬细胞代谢等炎症性疾病中检测到[33]。PI3K-Akt 信号通路是体内重要通路之一，研究发现，通过下调PI3K-p110 蛋白水平的表达，可以降低PI3K-p85 和AKT 磷酸化水平，抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞中的PI3K-Akt 信号通路的活化，起到抗炎的作用[34]。JAK-STAT 信号通路是机体内非常重要的信号通路之一，在促炎细胞因子的产生中起着关键作用[35]。C 型凝集素受体（CLRs）是一大类蛋白质超家族，可以产生炎症细胞因子和趋化因子，触发对病原体的先天性和适应性免疫，从而起到抗真菌的作用[36]。

综上所述，本研究通过运用网络药理学和分子对接技术对金鸡胶囊治疗PID 的活性成分和作用机制进行了预测，结果表明金鸡胶囊通过作用于多靶点、多条通路治疗PID，为金鸡胶囊治疗PID 作用机制提出了一定的参考依据。