龟鹿二仙胶治疗阿尔茨海默病研究进展及其抗氧化应激的网络药理学分析*

何蕾，郭锦晨，韩辉，宋宇琪，夏泽华，李子龙

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230038

2 新安医学教育部重点实验室 安徽合肥 230038

3 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年性痴呆，以认知功能恶化和行为改变为主要临床特征的神经退行性疾病，影响全球近5000 多万人，是导致死亡的第五大原因[1]。目前治疗AD 的策略集中在缓解症状上，常以胆碱能和谷氨酸能神经传递为靶向改善症状，但无法解决神经退化的根本问题[2]。随着人口老龄化的深入，AD 的潜在患者愈发增多，给家庭及社会带来沉重的经济负担[3]，因此寻找行之有效并且相对价廉的治疗方法迫在眉睫[4]。研究显示，中医药在治疗AD 上具有一定优势，且不良反应少[5]。补肾生髓法是中医治疗AD 的经典治法之一，龟鹿二仙胶作为补肾生髓法的代表方剂，可以有效改善AD 的症状，但由于龟鹿二仙胶成分较复杂，其治疗AD 的具体作用机制仍缺乏有力证据证明。而随着AD 机制研究的深入，越来越多证据显示氧化应激是AD 形成与发展的重要机制之一，然笔者在综述龟鹿二仙胶治疗AD 的进展情况时尚未发现龟鹿二仙胶改善AD 氧化应激指标及影响相关蛋白表达等研究。网络药理学与中医整体观念具有共通性，可以预测草药中存在的化合物的多个靶点与特定疾病相关的多个基因之间的相互作用，是研究中药药理的方法之一[6]。分子对接可以通过评估网络中组分与靶点的结合能来揭示网络中组分与靶点之间的相互作用，提高网络的准确性[7]。笔者试用网络药理学及分子对接技术分析龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的机制，以期为未来研究龟鹿二仙胶治疗AD 的作用机制提供参考。

龟鹿二仙胶治疗AD 的研究进展

1 补肾生髓法治疗AD 的中枢机制研究概况

中医学认为肾虚是AD 发病的重要原因[8]，人体脑部思维活动及意识形态等皆可能与肾精关系密切[9]，正如唐容川《中西汇通医经精义·五脏所藏》所言：“事物之所以不忘，赖此记性，记在何处，则在肾精”。《灵枢·海论》指出“脑为髓之海”，惟有髓海充足时脑络才能得到充分滋养。补肾生髓法是中医治疗AD 的经典治法之一，肾为先天之本，可藏精生髓，而髓由精化，故肾精充盈，则脑髓充满，髓生则益脑充脑，从而达到改善AD 症状的作用。研究发现，补肾生髓法治疗AD的作用机制包括通过各种信号通路调节突触蛋白的表达[10-11]、减弱神经炎性反应[12]、抗氧化应激[13-14]、营养大脑神经、改善大脑代谢[15]以及改善脑部血液循环[16-18]。从现代药理学、生物学等角度诠释了“肾生髓，脑为髓海”的中医理论。

2 龟鹿二仙胶治疗AD 的药理作用研究进展

补肾生髓法的代表方剂龟鹿二仙胶出自于明代王三才的《医便》，由龟板胶、鹿角胶、枸杞子、人参4味中药组成，方中以血肉有情之品龟板胶及鹿角胶阴阳双补并为君药，现代药理研究发现二胶含有大量蛋白质、多种氨基酸以及各种微量元素等多种化学成分，具有显著补脑、调节代谢、延缓衰老等多重作用[19-20]，配合人参、枸杞子益气养阴，健脾补血，助君药滋补肝肾精血。现代药理研究发现，人参具有抗衰老[21-22]、益智[23-24]、增强学习记忆能力[25-26]等作用，可通过影响突触功能可塑性及神经发生、β 淀粉样蛋白水平、线粒体功能及氧化应激、Tau 蛋白神经毒缠结、神经炎症过程等多个途径减轻AD 患者症状[27]；枸杞具有抗氧化[28-29]、抗衰老[30-31]、神经保护[32-33]等作用，其提取物可显著降低皮层神经元中Aβ 寡聚体水平及Aβ 诱导的神经毒性，从而改善AD 程度[34]。

龟鹿二仙胶具有补血、抗疲劳、抗氧化、抗衰老、增强免疫、保护中枢神经系统等作用，能够改善AD 患者炎症指标、脑部血液循环[16-18]。此外，在治疗其他神经系统疾病中龟鹿二仙胶亦显示出良好效果，如其可改善帕金森病患者睡眠质量[35-36]；通过影响下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，龟鹿二仙胶可调节创伤后应激障碍模型大鼠的行为学异常[37-38]。

3 龟鹿二仙胶治疗AD 的临床实验研究情况

研究表明[39-41]，龟鹿二仙胶与常规西药相比对AD 症状改善更加显著。然而关于其作用机制的研究较少，目前主要从改善脑血流、消除Aβ 沉积和tau 蛋白入手。

经 颅 多 普 勒 超 声（Transcranial Doppler Ultrasound，TCD）作为一种新型超声检查技术，可以直接获得患者血流速度、阻力等血流动力学指标，故可用于监测AD 脑血液循环[42]。马俊杰团队[16]引入TCD 监测龟鹿二仙胶对患者脑部血液循环的调节作用，结果显示该方对脑血管TCD 各参数指标皆有显著改善作用，且治疗组结果优于安理申组，说明龟鹿二仙胶补肾生髓与改善脑部血液循环之间可能存在逻辑关系。在此基础上，该团队运用MRI 进一步观察龟鹿二仙胶对血管周围间隙（Perivascular Spaces，PVS）、Virchow-Robin 腔（VRS）数目及直径的影响[17-18]。结果显示运用龟鹿二仙胶治疗第31 天无明显改善，第61 天与治疗前及对照组比较PVS、VRS 的数目无变化，而直径显著缩小。PVS 以及VRS 的分布与血管走行一致，可协助AD 脑部相关代谢产物β-淀粉样蛋白（Aβ）及Tau 蛋白等的循环及清除[43]。此外，该团队发现龟鹿二仙胶亦可改善TNF-α、IL-6及IL-1 等炎性因子水平。

近年来，越来越多的证据表明，氧化应激可能是导致认知衰老和AD 的关键机制之一[44]。氧化应激可通过促进Aβ 沉积、tau 蛋白过度磷酸化以及突触和神经元的丢失参与了AD 的发展[45]。改善氧化应激可以明显改善AD[46]。已有研究显示补肾生髓法可以改善AD 的氧化应激相关指标[47-48]，但笔者尚未发现龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激机制的研究，故试从网络药理学及分子对接探讨其发生机制，以供临床进一步研究。

网络药理学及分子对接分析

1 龟鹿二仙胶化学成分及相关靶点的获取及筛选

利用中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php）检索人参、枸杞子的化学成分，因检测不到龟板和鹿角胶的化学成分，故于BATMAN-TCM 数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、Herb 数据库（http：//herb.ac.cn/）中检索，并基于口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 进行筛选，但龟板和鹿角胶含有的化合物大多不符合筛选标准，因此结合相关文献纳入数据库未收纳的化学成分[49-51]，最终确定其活性成分。将活性成分输入TCMSP 和Drug Bank 数据库以查询与之对应的靶标蛋白，再将靶标蛋白输入UnitProt 数据库（https：//www. uniprot. org/）以查询其对应的基因名称。共得到96 个化学成分，其中人参22 个，枸杞子45 个，龟板17 个，鹿角12 个。筛去无对应靶点的成分，最终去除重复值后共获得龟鹿二仙胶67 个潜在的有效成分，靶点79 个。

2 AD 氧化应激靶点筛选

分 别 以“Alzheimer’s disease”“Oxidative stress”为关键词在GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）收集相关靶点并取交集，得到AD 氧化应激的相关靶标信息。结果发现，阿尔茨海默病及氧化应激靶点在Genecards 数据库中分别找到相关靶点11501、9629 个。将AD 氧化应激的靶点导入Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）作图，共有交集靶点6100 个，见图1。

图1 AD 与氧化应激共同靶点Venn 图

3 龟鹿二仙胶-AD 氧化应激的靶点网络构建及可视化

利用Venny2.1.0 导入AD 与氧化应激的交集，再导入龟鹿二仙胶相关靶点，得到疾病与药材共有靶点。使用Cytoscape3.9.1 软件进行龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的“活性成分-交集靶点-疾病”网络可视化分析。疾病与药材交集68 个，见图2。将成分-靶点、疾病-靶点关系表导入Cytoscape3.9.1 中，选出核心靶点构建成分-交集靶点-疾病网络，见图3。

图2 龟鹿二仙胶与AD 氧化应激共同靶点Venn 图

图3 龟鹿二仙胶有效成分与AD 氧化应激的成分-靶点网络图

3.1 龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的蛋白互作PPI网络的构建 在String 在线平台数据库（https：//string-db.org/）上传2.1.3 筛选得到的药物与疾病的交集靶点，在项目栏中选择研究物种为“Homo sapiens”，设置交互得分＞0.4，其余参数均保持默认，进行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并导出PPI 网络（见图4）及TSV 文件。运用Cytoscape软件中的CytoNCA 插件从导入的TSV 文件中利用Degree 大小筛选龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的关键靶蛋白，筛选过程及结果见图4，度值最高的主要包括IL6、PPARG、CASP3、ESR1、RELA 等。

图4 龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的PPI 网络

3.2 龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的PPI 网络聚类可视化 将龟鹿二仙胶与AD 的交集靶点导入Cytoscape 软件，应用MCODE 插件进行聚类分析。结果显示，龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的相关靶点主要有3 个聚类簇，聚类网络图根据评分的高低分别导出，可视化结果见图5（A-C）。

图5 龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的关键靶点聚类图

4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

将龟鹿二仙胶的有效作用靶点上传至David 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），限定人源，通过基因功能（gene ontology，GO）分析结果获取靶点主要作用过程信息。最终得到GO 条目304 条，包括生物过程（biological process，BP）203 条，细胞组成（cellular component，CC）43 条，分子功能（molecular function，MF）58 条，生物过程中排名靠前的有细胞内类固醇激素受体信号通路、乙醇反应、药物反应等；细胞组成分析中靠前的主要是突触前膜的组成成分、线粒体、突触后膜的组成成分、轴突末端等；分子功能分析靠前的主要是RNA 聚合酶II 转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA 结合、类固醇结合、酶结合等。将BP、CC、MF 排名前10 的条目导入微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）获得GO 富集分析柱状图，见图6。

图6 龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的GO 富集分析柱状图

同样在David 数据库中90 条获取KEGG 通路信息，富集分析结果比较靠前的主要是脂质和动脉粥样硬化、化学致癌作用-受体活化、癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路等。将富集结果导入微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/），对排名前20 位的结果绘制气泡图（见图7）。

5 活性成分与关键靶点的分子对接分析

使用TCMSP 数据库获取龟鹿二仙胶活性成分的2D 结构，利用AutoDock Tools 1.5.7 软件优化小分子结构、添加极性氢原子，使其还原为最低能量形式，更贴近对接时的状态。使用RSCB PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）获取关键靶点的三维结构，应用PyMOL 2.3.0 软件对关键靶点进行预处理，包括去除水分子和原有配体。应用AutoDock Vina 1.2.0 软件将处理好的成分配体与靶点蛋白进行分子对接操作，最后对对接结果进行可视化分析（图8）。

图8 龟鹿二仙胶核心成分与疾病关键靶点的分子对接示意图

选取网络图中度值排名靠前的3 个核心靶点IL6、PPARG、CASP3 以及排名前三的小分子山柰酚、β-谷甾醇和豆甾醇，结合能均＜-5.0（见表1）。

表1 核心靶点与主要成分的结合能

讨 论

本文综述了龟鹿二仙胶治疗AD 的研究进展，发现龟鹿二仙胶的药理研究和临床应用较少，在治疗AD 上目前主要研究了其脑代谢与脑血流机制。氧化应激途径是AD 的重要发病机制之一，已有实验表明补肾生髓法可以改善AD 患者氧化应激指标，然而尚未有补肾生髓代表方龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的相关研究。故本研究利用网络药理学及分子对接技术探究其干预AD 氧化应激的具体作用机制。

研究结果显示，龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的核心化学成分包括山柰酚、β-谷甾醇和豆甾醇，这与目前有关研究结果一致。山柰酚具有抗氧化[52]、保护大脑[53]等作用，可降低脂质过氧化和增加脑中的内源性抗氧化酶[54]，可通过抑制细胞凋亡保护脑细胞[55]，调节TLR4/NF-κB 等通路表达发挥神经保护作用[56]，诱导细胞自噬发挥对多巴胺能神经元的保护作用[57]。山奈酚可通过减轻氧化应激和炎症，降低aβ 诱导的神经毒性，调节胆碱能系统等途径改善AD认知障碍[58-59]。β-谷甾醇可干扰多种细胞信号通路，包括细胞周期、凋亡、增殖、抗氧化、血管生成等，且无明显毒性[60]。Ayaz 等人[61]对β-谷甾醇进行了体外、体内、行为和分子对接研究，研究显示，β-谷甾醇具有强大的抗胆碱酯酶和抗氧化潜能，能充分到达大脑并抑制参与胆碱酯酶代谢的酶，并起到自由基清除剂的作用，而在SWM、y-迷宫和平衡木测试中发现β-谷甾醇可以改善认知缺陷，短期记忆和运动障碍，可用于治疗AD 记忆缺陷障碍。豆甾醇具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、保护精神状况等作用[62]，Yadav 等人[63]对氯胺酮诱导的小鼠精神病模型进行行为学研究及生化检测，结果发现豆甾醇可以改善模型小鼠的自发活动、刻板行为等行为表现，增加γ-氨基丁酸、谷胱甘肽水平，减少多巴胺、丙二醛、TNF-α 水平并降低乙酰胆碱酯酶的活性，显示了其在治疗精神病症状方面的潜在作用。

PPI 网络分析结果显示IL6、PPARG、CASP3 为PPI 网络中度值排名前3 的靶点，提示其可能是龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的核心靶点。IL-6 是参与调节神经系统免疫应答和炎性反应的重要细胞因子之一，可促进单核细胞产生多种炎性细胞因子，作用于多种神经系统的靶细胞[64]。AD 患者大脑中Aβ 沉积会引起一些免疫分子参与炎性反应，使IL6 等炎性因子水平增加，同时IL-6 的增加也可促进Aβ 的积累，破坏神经完整性[65]。此外，IL-6 还可通过影响下游信号通路炎性因子的表达，加剧氧化应激对脑组织的损害，导致神经元萎缩凋亡[66]。PPARG 主要在脂肪、肌肉以及神经系统中表达，可调控与脂肪代谢相关的转运蛋白和脂肪酶的表达[67]，介导抗血管生成过程[68]，在控制炎症、改善动脉粥样硬化和调节免疫过程中发挥重要作用[69]。研究显示[70]，PPARG 激动剂可改善AD 动物模型的认知行为，可能是治疗AD 的一种有潜力的方法。CASP3 为细胞凋亡途径中最关键的酶，大量研究证实CASP3 介导的淀粉样前体蛋白切割是AD中淀粉样变和神经元细胞死亡的潜在机制[71]。

本研究从网络药理学及分子对接的角度阐释了龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激的机制是多成分-多通路-多靶点的网状复合协同作用的结果，而得出的核心成分、靶点及通路为进一步探讨其发挥效用的活性成分的物质基础和具体作用机制研究提供了方向，后续尚需系统的体内外实验以及具体的靶点验证进一步证实龟鹿二仙胶干预AD 氧化应激作用的网状内在联系及具体准确的靶向机制。