生物活性硒肽制备及功能的研究进展

杨 涛, 牛茵茵, 向极钎, 张 驰, 商龙臣

(湖北民族大学生物与食品工程学院1,恩施 445000)(恩施土家苗族自治州农业科学院2,恩施 445000)

硒是一种人体必要的微量元素,其缺乏往往导致多种疾病如大骨节病、克山病和癌症等[1]。硒的营养价值日渐为人所知,各类富硒食品如富硒茶、富硒大米、富硒麦芽等也不断出现在消费者的视野中。膳食硒是决定机体中硒元素生物利用度的关键因素之一,随着居民健康意识不断地提高,富硒食品成为了当前消费者主流的补硒途径[2, 3]。

活性硒肽不仅是优质的硒补充剂,更是生物活性肽的重要组成部分。生物活性肽是一类广泛存在于动、植物及微生物蛋白中的天然小分子聚合物,一般由2～20个氨基酸组成[4]。食源性活性肽具有免疫原性低、特异性强、毒性低等优点,其潜在的健康益处也使其常被用作功能性食品与新型药物的生产与开发中[5, 6]。随着硒肽促健康作用研究不断地深入,研究人员充分报道了硒肽的相关研究。如贾蕾等[7]重点论述了硒肽的生物活性并揭示了硒肽在体内的抗氧化机制。黄继红等[8]评价了当前硒肽的主要制备方法及其生物利用度体系。Zhang等[9]综述了硒肽结构与活性之间的关系,并总结了硒肽的分离、纯化和鉴定过程中的关键技术。这些研究在硒肽制备及相关活性研究中发挥着重要作用,但受到我国硒资源分配不均及生产技术的限制,硒肽主要从富硒植物中获取[7, 10]。硒肽的相关研究主要集中于传统酶解法制备硒肽、硒肽的分离与纯化等方面,此类方法存在周期长、效率低等问题。利用新兴的计算机技术辅助制备活性肽并探究其生物学功能与作用机制的方法有效缓解了天然活性肽在上述研究的痛点,而在硒肽相关研究中则并不多见。

综述了当前国内外硒肽的生物活性、制备方法及生物信息技术辅助活性肽制备方面的研究进展,以期为硒肽在功能性食品、硒补充剂或肽类药物的开发与应用方面提供参考。

1 硒肽的生物学功能

探究源于富硒农产品中硒蛋白、硒肽的生物活性一直以来都是硒营养学领域的研究热点[11]。相比硒蛋白,硒肽更易于被人体消化与吸收,且本身也兼具抗氧化、免疫调节等多种生物学功能。因此,探究这些小分子化合物的生物活性具有重要意义。

1.1 抗氧化活性

机体的新陈代谢往往会产生活性氧类自由基,当自由基的生成累积达到一定量时,则会导致氧化应激[12],进而导致心血管疾病、糖尿病、癌症等疾病的发生,损害人体健康[13]。因此,摄入外源性抗氧化剂对于维持机体氧化还原状态至关重要。Zhu等[14]研究发现,分子质量小于1 ku的碎米荠混合硒肽对D-半乳糖诱导的氧化应激小鼠具有一定的抗氧化和抗疲劳功能。

在肽类抗氧化剂中,部分氨基酸也具有一定的抗氧化活性,如:芳香族氨基酸(Tyr、Trp、Phe和His)可贡献自身电子将自由基转化为稳定物质[15]。Li等[16]研究表明,硒肽清除自由基的能力强于非含硒肽,且硒肽中的硒含量与其抗氧化能力呈正相关关系。而硒具有抗氧化特性得益于硒元素的外层电子结构疏松,是良好的亲核试剂。研究表明,含硒化合物与活性氧类自由基发生反应时,生成的含Se-O键氧化物无法形成π键,导致含Se-O共价键氧化物易发生还原反应[17],含硒化合物也因此具有良好的抗氧化活性。

1.2 免疫调节活性

免疫系统是机体预防和控制各类疾病的自主防御系统[18]。免疫活性肽主要通过增强免疫细胞功能或提高免疫细胞因子活性等方式在人体免疫系统中发挥多种调节作用[19]。Wu等[20]探究了2种源自富硒水稻的硒肽(T-Se-MMM和Se-MDPGQQ)对Pb2+诱导的小鼠海马体HT22细胞氧化应激的神经保护机制,其研究结果表明,2种硒肽通过增强HT22细胞活力和减少此细胞凋亡的方式抑制Pb2+诱导的细胞毒性作用,小鼠HT22细胞内超氧化物歧化酶活性则分别提高了47.79%和13.93%,谷胱甘肽过氧化物酶活性也分别提高了94.7%和78.73%。王程等[21]的研究表明含硒65肽(Se-ZnCu-65P)可有效增强由脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。

1.3 抗高血压活性

高血压是导致心脑血管疾病、肾脏疾病的首要风险因素[22],其影响范围甚广、发病机制复杂,且降压药副作用明显[23, 24]。因此,食物中天然具有抗高血压活性的多肽日渐引起了相关学者的关注[25],硒肽被认为是一种相对安全的血压管理补充剂。研究最广泛的具有抗高血压活性的多肽是血管紧张素转换酶(Angiotensin-Converting Enzyme,ACE)抑制肽。ACE可将无活性的血管紧张素Ⅰ(Angiotensin I,ANG Ⅰ)转化为有活性的血管收缩剂即:血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,ANG Ⅱ),从而导致血压上升。高东方等[26]表明使用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶共同水解条件下制备的ACE抑制肽活性显著高于其他单一蛋白酶水解制备的ACE抑制肽活性(P<0.05)。陈冰冰等[27]制备了富硒辣木叶蛋白ACE抑制肽,其ACE抑制率达到88.97%。

1.4 其他功能活性

研究人员还发现了硒肽的其他生物活性。如Liao等[28]制备了一种具有抗癌功能的含硒核桃肽(WP1-Se-NPs),并发现其能通过诱导人乳腺癌细胞MCF-7发生S期(DNA合成期)细胞停滞和DNA断裂方式使MCF-7细胞凋亡。Liu等[29]研究表明,富硒大豆肽提高了细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活性,从而效缓解了由CCl4引起的肝细胞纤维化。Wu等[30]研究表明源自富硒蛹虫草的2种硒肽(VPRKL-Se-M和RYNA-Se-MNDYT)对肠道菌群及神经炎症具有一定的调节作用。

2 硒肽的制备方法

2.1 酶促水解法

酶促水解法是活性肽制备最常用的方法,因其操作简单且不破坏其他营养物质而被广泛应用于硒肽的制备[31, 32]。生产活性肽的商业酶制剂主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶等。酶的作用位点是影响多肽分子质量及其活性的关键因素之一,研究人员根据测定不同蛋白酶对蛋白质的水解度进而判断酶对蛋白的水解效率,经鉴定后筛选出目标肽段[33]。尽管不能通过酶切位点直接确定水解产物的氨基酸序列与活性,但相关研究表明,使用枯草杆菌蛋白酶水解的产物比使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的产物具有更高的生物活性[34, 35]。贾蕾等[36]使用碱性蛋白酶酶解碎米荠硒蛋白,并发现分子质量小于1 ku碎米荠硒肽具有良好的体外抗氧化活性,所得硒肽的硒含量为362.378 mg/kg。虽然酶促水解法是一种高效且能有效控制酶解程度的方法,但在实际生产应用中需要反复试错,且酶解产物种类繁多,品控困难。

2.2 化学合成法

化学合成法是一类基于已鉴定出氨基酸序列的多肽直接合成方法,因保护基形态不同分为液相合成法与固相合成法[37]。液相合成法是在液态保护基下使用缩合剂将氨基酸添加至多肽链上,或分段缩合以制备目标肽段。Shimodaira等[38]使用液相合成法合成了硒谷胱甘肽(G-Se-H)类似物G-Se-G,其产率高达98%。液相合成法具有成本低、适用范围广、保护基种类多等优势,但因其存在操作难度大及产品分离复杂等问题,主要适用于短链肽的生产[39, 40]。固相合成法则是将氨基酸的C端固定在树脂载体后,将其N端与第2个活化的氨基酸通过缩合反应连接,以此制备目标肽链。相比液相合成法,固相合成法具有操作简便、易实现自动化、产物易分离等优势,适用于中长肽或肽类药物的制备[39]。邹险峰[41]利用固相合成法成功合成含硒8肽(Se8P,DGR-SeC-SeC-RGD),并发现其能高效诱导人黑素瘤A375细胞凋亡。Fang等[42]以源自富硒大米蛋白水解物中的含硒肽为参照,使用固相合成法合成了硒肽T-SeM-MM,其纯度高达98%,发现其具有一定的免疫调节活性。

随着固相合成法在多肽生产、制药领域的广泛应用与发展,多肽固相合成系统也随之出现。有些仪器合成公司开发了多肽合成仪器产品,但因其价格昂贵、维护成本高而未能广泛应用。Nathaniel等[43]使用化学实验室常见流体处理部件设计出一款经济的多肽固相合成系统,该系统实现了以每个氨基酸残基1美元的成本生产合成多肽,大幅降低了多肽定向合成的价格。

2.3 多肽的硒化修饰

将无机硒与天然多肽螯合转化为有机硒的多肽硒化修饰方法主要是利用Se4+可以提供的4d空位轨道与提供孤对电子的N和O元素形成配位键,以实现多肽的硒化修饰。相关研究表明,Se螯合的主要基团是—NH2与—NH,而—COOH也参与螯合过程中配位键的形成[9]。Li等[44]使用螯合方法制备了具备抗癌活性的硒肽ACBP-S-Se,其研究结果表明,ACBP经巯基化修饰后,以巯基作为Se的结合位点,形成了ACBP-S-Se肽。Ye等[45]以大豆分离蛋白肽(SPIPs)为对象,螯合制备硒肽Se-SPIPs,其研究结果证实了Se-SPIPs相比SPIPs具备更强的羟基自由基清除活性,且发现Se-SPIPs通过增强抗氧化酶的活性的方式修复了由H2O2介导Caco-2细胞的氧化损伤。

目前,经典酶解法制备硒肽还存在效率低、纯化难度大、时间成本高及与其他活性成分作用产生协同效应等诸多问题,但解析天然硒肽的精确结构是化学合成硒肽的前期基础[46, 47]。硒化修饰法制备硒肽虽操作简便,但此法的硒肽制备效率较低,无法满足工业生产需求。因此,优化传统硒肽制备方法、提高硒肽的制备效率是硒肽工业发展的必然趋势。随着计算机技术的发展,生物信息学方法利用数据库中有效信息,在优化多肽制备工艺及多肽活性验证中发挥了重要作用,有望为促进传统方法提供强大的驱动力。

3 生物信息学在多肽制备中的应用

生物信息技术是一种结合计算机科学、生命科学、统计分析学及数学对复杂生物数据进行采集、处理、存储、分析和解释,从而揭示其所赋有的生物学特性的方法[48]。生物信息学方法在多肽制备主要有以下三方面的应用:评估蛋白质作为生物活性肽前体的潜力;模拟酶解并计算关键工艺参数;识别新型活性肽并确定其生物活性[34,49]。这类方法能大幅度降低时间与经济成本,且在蛋白质和多肽的结构、活性预测、构效关系、释放特定活性肽的酶切位点等研究中有着重要意义,因而倍受国内外学者关注[50-52]。

3.1 蛋白模拟酶解及多肽活性预测

蛋白模拟酶解是一种利用数据库(如:NCBIProteinDatabase)检索获得蛋白质序列,再结合目标需求选择虚拟蛋白酶进行酶切,从而获得活性肽序列的方法。其操作流程如图1所示,首先使用多肽数据库(如:BIOPEP-UMW)中“Profilesofpotentialactivity”工具对检索得到的蛋白质进行评估,该工具是利用已知的肽序与其活性之间的关系检索出蛋白质内潜在的活性肽片段类型与位置,并计算出生物活性肽片段出现频率[53]。使用在线模拟酶解工具“Enzyme(s) action”基于酶的切割位点对蛋白质执行模拟酶解[54]。模拟酶解后,将得到的序列输入至多肽活性预测程序(如:PeptideRanker),并根据程序给出的预测得分值(超过0.5即认为该多肽具有生物活性[55])筛选出具有活性的多肽片段,结合多肽数据库(如:BIOPEP-UMW)中已有的生物活性肽序列分析肽段的生物活性。此外,一些模拟酶解相关工具在分析多肽生物活性中显示出强大的能力与优势,如PepCalc可预测多肽的理化性质,NCBI网站中的BLAST分析工具可用于分析蛋白质和多肽之间的同源性以评估其功能等,现将蛋白、多肽数据库及模拟酶解相关工具列于表1。

表1 蛋白、多肽数据库及模拟酶解相关工具[59-72]

图1 蛋白模拟酶解的流程(图片字体有修改)

随着活性肽潜在的健康益处逐渐清晰,这种利用计算机工具和数据库资源获得活性肽序列的方法被广泛报道。周湘人等[56]研究表明,大米谷蛋白经虚拟蛋白酶模拟酶解后得到的虚拟活性肽主要为二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽及ACE抑制肽,且两类活性肽均无细胞毒性。Ma等[57]使用PeptideCutter工具模拟酶解了来自青蛙表皮分泌的GV30蛋白,发现酶解产物中的一条多肽(GV21)对金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用。Fu等[58]使用PepideRanker程序对模拟酶解的多肽进行活性预测发现,FP与WG两种二肽的预测得分值均为0.99,FP多肽已在西班牙曼切戈奶酪中发现并鉴定为ACE抑制肽(IC50=1 215.7 μmol/L),而与FP相同得分的WG鲜见报道,其是否具有生物活性还有待进一步评估。尽管PeptideRanker程序不能100%的预测出肽的生物活性,但因其操作简便、预测速度快等优势,该程序仍然适合作为基于结构与肽活性关系的初步探索工具。

3.2 神经网络模型在多肽制备中的应用

神经网络(Artificial Neural Network,ANN)模型是一种基于生物神经网络原理建立的数据模拟系统。ANN模型是通过拟合现有数据的规律的方式,探索数据中复杂系统关系的人工智能技术之一[73]。ANN因高度的并行性、独特的鲁棒性(Robust的音译,指计算机软件或者程序在输入错误、网络过载、磁盘故障等异常状况下计算机或程序不死机、崩溃的能力)和具有自我学习能力等优点,在解决非线性、非稳定态的工艺优化及过程模拟等问题中得到了广泛应用[74, 75]。相关研究表明,在复杂的非线性多元建模中,ANN模型比Box-Behnken响应面(Response Surface Methodology,RSM)模型具有更高精度的拟合响应值及预测值,且ANN模型正在发展为RSM模型方法的代替方案[76, 77]。刘盟梦等[78]使用ANN模型模拟了牡蛎蛋白酶解程度与OH-自由基清除活性间的关系,其模型相关系数为0.994 3,实现了牡蛎抗氧化活性肽的可控制备。岳阳等[79]使用ANN模型及遗传算法方法共同优化了大米抗氧化肽酶解工艺,在最佳工艺条件下制备的大米抗氧化肽其ABTS自由基清除率达到82.22%。

随着人工智能技术的高速发展,ANN模型不仅应用于优化工艺过程,还在多肽的活性预测[80]、定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Relationship,QSAR)模型的建立[81]、质谱解析[82]、多肽毒性预测[82]及多肽含量检测[83]等领域中发挥着重要应用。

3.3 分子对接技术在多肽制备方面的应用

分子对接(Molecular Ducking)技术是通过计算机程序预测与评估配体和受体间的结合过程的方式来探究小分子物质(如:活性肽)作用机制的重要工具[84, 85]。该技术是基于几何与能量互补的原则,将配体分子结合到受体的口袋(活性位点)上,并通过算法给出的得分值实时评价配体对受体目标结合的特异性,找到两分子结合最佳状态的方法。Zhang等[86]使用AutoDock 4.2软件以最小结合能为指标(Binding Energy)完成了84条分子质量小于1 ku的硒肽与DPPH分子对接,并收集了7条结合自由能小于-5 kcal/mol的硒肽,人工合成了上述7条肽段后验证了其抗氧化活性结果表明,抗氧化能力最弱的硒肽(RVSeMI)清除DPPH的EC50为5.65 mmol/L。随着核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)光谱和X射线晶体衍射(X-ray diffraction,XDR)等蛋白质结构解析技术的发展,分子对接技术已被广泛应用于多肽药物的探索,如筛选抗癌细胞增殖肽[87]、ACE抑制肽[88]和DPP-Ⅳ抑制肽[89]等。

目前,用于学术研究及商业应用开发的分子对接程序约有60多种,包括Duck、AutoDuck、FlexX、Glide、GOLD等。在多肽药物设计的实际应用中,预测准确性与位姿预测的正确性主要取决于肽的柔性键数量、程序的构象搜索算法和结果评价方法[90]。而启发式遗传算法在解决构象搜索及全局优化问题上受到了研究人员的普遍认可,有关常用的分子对接软件内在算法及打分函数情况如表2所示[91, 92]。评估这些程序的关键因素包括:蛋白质与配体复合物评估的正确率、位姿预测正确性、目标蛋白质因素、配体富集率、处理时间、均方根偏差(Root Mean Square Deviation,RMSD)、配体富集率、接收器操作特性(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线和统计显著性结果等[93]。Oda等[94]评估了458种复合物对GOLD、eHiTS 2009、AutoDock 4.0、Auto Dock Vina、Fred 2.2.3和DOCK 6.3的配体结合程序,结果表明GOLD、eHiTS和Fred的成功率优于AutoDock、AutoDock Vina和DOCK(AutoDock Vina>AutoDock),并表明在对接计算之前应该对配体分子进行一些构象搜索。

生物信息技术因其操作方便且近乎没有资源消耗,在非修饰肽的制备及活性探究等领域已经得到了广泛应用。此类技术在硒肽制备上的应用并不多见,其主要原因可能有:1)硒与多肽均可具备一定的生物学功能,硒肽的生物学功能便更为复杂;2)硒肽相关数据的数量不能满足揭示其构效关系,导致一些工具还不支持硒蛋白、硒肽和硒代氨基酸使用;3)计算机辅助工具的算法及蛋白质的数字结构信息难以达到100%的准确度。因此,在使用这些工具辅助工具的同时还应结合实际情况进行验证以及对程序算法进行优化修正。

4 结语

随着人们对硒营养价值探索不断深入,生物活性含硒肽作为硒补充剂的重要载体,其对人体健康的重要性已深入人心,也促使相关科研工作者持续地开展深入研究。然而,尽管有关含硒肽的分离纯化和及其生物学功能的报道日渐增加,但关于人工合成硒肽的安全性、硒肽能否完整进入体内并发挥其生物学功能等问题,仍缺乏深入的研究与系统性的评估。此外,硒肽的传统制备方法往往耗时长,产物纯度低且缺乏有效的递送手段,极大地制约了生物活性含硒肽的研究与应用。未来,硒肽的制备应在传统的方法上不断与蛋白质组学、多肽组学及生物信息学等方法的相结合,以更加清晰明确的路径指导生物活性含硒肽的制备,推动硒肽产业高效、快速且稳定地发展。