免疫磁珠高通量自动净化-超高效液相色谱法快速测定饲料中玉米赤霉烯酮

王 蒙, 陈金男, 叶 金, 李 丽, 王松雪, 张 颖,吴 宇, 刘洪美

(上海理工大学健康科学与工程学院1,上海 200093)(国家粮食和物资储备局科学研究院粮油质量安全研究所2,北京 102629)

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物,分子式为C18H22O5,不溶于水,易溶于有机溶剂,具有荧光特性,在玉米和小麦等谷物类饲料中广泛存在[1]。玉米赤霉烯酮的毒性主要体现在免疫毒性、生殖毒性、细胞毒性、遗传毒性和器官毒性等[2]。刘双双等[3]研究发现ZEN在终浓度10、20、30 mol/L下均可显著或极显著地降低脂多糖诱导的B细胞相对活性,并导致细胞表面标识分子CD69、CD71、CD138的表达量显著下降。此外,ZEN还可抑制B细胞的增殖,且呈剂量效应关系。玉米赤霉烯酮可直接通过抑制小鼠B淋巴细胞的活化、增殖、分化,影响体液免疫的进程,从而对动物机体产生免疫抑制作用。赵虎等[4]在基础日粮中分别添加1、2、3 mg/kg质量分数的玉米赤霉烯酮饲喂仔猪,与饲喂基础日粮的对照组相比仔猪脾脏、肝脏和肾脏重量显著增加。Wu等[5]将48只青春期前母猪分为对照组和3个实验组(分别在基础日粮上添加200、800、1 600 μg/kg的ZEN),结果显示ZEN添加量最大的实验组与对照组相比母猪的血清总抗氧化能力和血清超氧化物歧化酶活性均显著降低,天冬氨酸转氨酶活性显著升高,引起肝毒性。李樵峰等[6]将蛋鸡分成对照组和2个实验组(分别在全价基础日粮上添加1和2 mg/kg的ZEN),结果显示实验组的肝脏病理组织切片中出现小泡性脂肪病变和肝组织坏死和纤维化。ZEN对饲料及其产品的污染不仅会导致养殖业遭受经济损失,而且ZEN 在可食用动物组织或动物产品中的残留对人类健康具有很大的威胁。许多国家都对ZEN制定了限量标准,目前其他国家对ZEN在谷物及饲料中的限量范围在0.02～1 000 μg/kg[7]。我国规定谷物及其制品中ZEN的限量为60 μg/kg[8],饲料原料及其产品中的限量为0.1～1.5 mg/kg[9]。

饲料组分复杂,常掺有甜菜碱、抗菌肽、低粗蛋白、混合有机酸、霉菌毒素吸附剂等添加剂和营养物质[10-14],给ZEN的准确检出造成阻碍。因此,样品前处理方法就显得尤为重要。现有的前处理方法主要有免疫亲和柱法(IAC)[15]、固相萃取法(SPE)[16]、QuEChERS[17]等。上述方法存在操作繁琐、耗时长,成本高等问题。免疫磁珠(IMB)是由载体微球和免疫配基相结合的一种磁性纳米粒子,具有超顺磁性、尺寸小等特点[18,19],在食品安全检测领域展现出独特的优势,具有操作简单、准确度高、净化时间短等优点[20-22]。玉米赤霉烯酮常用的分析测试方法有免疫检测法、薄层色谱测定法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法等(表1)。综合比较各种检测方法,超高效液相色谱法由于使用了粒径更小的填料色谱柱,能够缩短分析时间而且不需要质谱仪这类价格昂贵的仪器,非常适合准确、快速地检测大量饲料样品中的ZEN。

表1 玉米赤霉烯酮检测方法及特点

研究将免疫磁珠技术应用于饲料原料及其产品中的玉米赤霉烯酮的净化,结合超高效液相色谱分析方法,旨在实现饲料原料及其产品中玉米赤霉烯酮准确、快速检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

玉米赤霉烯酮单克隆抗体(纯度>97.3%)、NHS基团-磁珠[20%(体积分数),10～30 μm]、玉米赤霉烯酮免疫亲和柱;甲醇、乙腈(色谱纯)、无水乙醇(分析纯);甲醇中玉米赤霉烯酮溶液标准物质[GBW(E)100301];定性滤纸(直径为15 cm)。

1.2 主要仪器与设备

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪,Waters Acquity FLD荧光检测器,JJHZ10真菌毒素全自动净化仪,MTV-100多管漩涡混合仪,SQP电子天平,N-EVAP112快速溶剂吹干器。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱:Waters BEH-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温 40 ℃,样品温度 10 ℃;进样量 10 μL。流动相:水-乙腈,按体积比 45∶55 混合,等度洗脱,流速为 0.2 mL/min。荧光检测波长:激发波长 303 nm,发射波长 440 nm。

1.3.2 免疫磁珠的制备

将抗体恢复至室温,吸取一定量加到离心管中,加入适量MES缓冲液制成抗体稀释液,混匀备用。NHS基团-磁珠充分混匀后,吸取一定量,用无水乙醇洗2遍后,快速加入抗体稀释液混匀,孵育2 h。孵育结束后,磁分离弃去上层液。加入适量体积分数为2%甘氨酸溶液封闭2 h。封闭结束后,磁分离弃去上层液。用0.1%(体积分数)PBST、PBS各清洗2次磁珠,4 ℃冷藏保存在PBS中。

1.3.3 样品前处理方法

免疫磁珠自动净化前处理方法流程如下:将饲料恢复至室温备用,称质量前充分混匀。准确称量(10.00±0.01)g样品(基质加标样品应静置过夜以挥发标准溶液中的有机溶剂),加入40 mL体积分数为90%的乙腈水;充分震荡20 min,使用定性滤纸过滤。准确吸取2 mL滤液加到试剂盒1孔位,将试剂盒放到真菌毒素全自动净化仪中,启动程序自动净化。净化结束后,准确吸取洗脱溶液0.5 mL于10 mL离心管中,在55 ℃氮气环境下缓慢吹至近干。吹干后用0.5 mL流动相复溶。使用0.2 μm滤膜过滤复溶溶液,上机检测。

1.3.4 分析方法验证

用逐级稀释法,以信噪比(S/N=3)和(S/N=10)确定检出限和定量限。对该方法进行加标回收率、重复性、稳定性测试。对饲料样品进行3个不同浓度(低、中、高)基质加标回收率的测定。基质加标后在室温下放置过夜,以蒸发加入的标准溶液溶剂。在1个加标水平(150 μg/kg)下测定重复性,重复测定4 d,测试该方法的稳定性。

1.3.5 标准工作曲线的绘制

配制ZEN标准溶液方法:根据需要准确吸取适量标准储备液,用流动相稀释,配制成10、25、50、100、200、500 ng/mL的系列标准工作液,4 ℃避光保存。将标准溶液混匀后使用超高效液相色谱检测,以目标物质的浓度为横坐标,目标物质的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.6 数据处理软件

采用Empower®3软件进行数据采集、整理和导出。使用Microsoft Excel®2016和OriginPro8.5软件对实验数据进行统计分析、作图。

2 结果与分析

2.1 稀释液的优化

饲料组分丰富,成分复杂,容易对毒素的净化及检测过程造成不利影响,试剂盒样品孔稀释液作为抗原与抗体反应的溶剂环境,对净化效果有显著影响。经过预实验后选择仔猪饲料进行稀释液的优化。比较了6种稀释液及二次离心的方式对样品孔稀释液进行了优化,结果如图1a所示。常用的PBS和0.1%(体积分数)PBST缓冲液回收率分别为107.0%和93.0%,但是净化后样品孔和第1个清洗孔出现大量絮状物,磁珠有不同程度的残留,因此平行性较差,相对标准偏差偏大。在稀释液中加入1%(体积分数)PEG作为分散剂,回收率降低且絮状物残留状况没有改善。在0.1%(体积分数)PBST中添加BSA和0.1%(体积分数)TBST 2种稀释液的回收率分别为96.8%和108.1%满足测试需求,但净化后样品孔仍有部分絮状物。二次离心法和0.1%(体积分数)吐温20-水净化效果最好,回收率约100%,且净化后各孔位干净清澈,无杂质。图1b液相色谱图显示猪饲料使用0.1%(体积分数)吐温-20水作为稀释液,目标峰后几乎无杂峰,净化效果优于二次离心,同时二次离心法增加了前处理步骤和时间。之后用0.1%(体积分数)吐温-20水作为稀释液净化其他3种不同饲料,净化效果液相色谱图如图1c所示,各色谱峰峰型一致。因此,样品孔位稀释液为水中加入0.1%(体积分数)的吐温20。

注:a 不同稀释液及上清液处理方式净化后回收率;b 不同稀释液及上清液处理方式液相色谱图;c 稀释液为0.1%(体积分数)吐温20-水对不同饲料净化效果。方法1表示稀释液为PBS;方法2表示稀释液为0.1%(体积分数)PBST;方法3表示稀释液为1%(体积分数)PEG/0.1%(体积分数)PBST;方法4表示稀释液为0.1%(体积分数)吐温20-水;方法5表示稀释液为0.1%(体积分数)PBST+BSA;方法6表示稀释液为0.1%(体积分数)TBST;方法7表示样品离心后上清液与0.1%(体积分数)PBST混匀后二次离心。

2.2 方法的线性关系、检出限、定量限

在10～500 ng/mL浓度范围内制备标准工作液。Y=225.57X+184.2,R2=0.999 93,线性关系良好。方法的检出限为4.5 ng/mL,定量限为15.0 ng/mL,满足饲料中玉米赤霉烯酮的日常检测。

2.3 方法准确性与精密度

选取鸡饲料和猪饲料作为基质,参照GB/T 27404对方法及方法确认的要求进行方法准确性和精密度的检验。选择加标质量分数为饲料限量标准的0.5、1.0、2.0倍。充分混匀静置后,按照1.3.3样品前处理方法处理样品,计算加标回收率和相对标准偏差(RSD),鸡饲料3种质量分数的加标回收率在96.0～99.8%,RSD在1.8%～3.7%,猪饲料3种浓度加标回收率在92.6%～112.9%,RSD在1.0%～8.8%。结果表明,本法具有良好的准确性。具体结果见表2。

表2 免疫磁珠法净化后基质加标回收率

2.4 日间精密度

连续4 d采用免疫磁珠净化法进行同种饲料加标回收测试,所得结果如表3。方法连续4 d的加标回收率在97.0%～98.9%,日间精密度在5.7%～5.9%,具有良好的重现性。

表3 该方法的日间精密度

2.5 实际样品测试及方法比对

表4表示的是采用国标法中的免疫亲和柱法和免疫磁珠法对豆粕、DDGS(4个不同厂家)及14种牛、羊、鸡饲料分别进行前处理后得到的检测结果,采用t检验,评价2种净化方法的测定结果是否一致。经t检验分析,2种净化方法的测定结果无显著性差异(P>0.05)。因此,本方法可用于大批量饲料产品中ZEN含量的检测。

表4 实际样品的测定结果

3 结论

本研究建立了一种自动、高通量免疫磁珠净化-超高效液相色谱检测方法,用于测定饲料原料及其产品中的玉米赤霉烯酮。在研究中发现,样品稀释液组成对净化后样品检测结果起重要作用,在水中加入0.1%(体积分数)吐温-20净化效果最好。在鸡饲料和猪饲料样品中玉米赤霉烯酮的加标回收率为92.6%～112.9%,相对标准偏差为1.0%～8.8%。连续4 d基质加标回收率在94.0%～106.3%,日间精密度在0.5%～3.0%。本方法简化了前处理步骤,实现净化过程的自动化,减少因实验人员操作造成的实验误差,提高了检测效率,采用超高效液相色谱进行分析测试,具有良好的准确性和精密度。目前,使用免疫磁珠净化饲料中的真菌毒素鲜有报道,多是对粮油产品的检测,其中大部分是对单一毒素的检测,未来需要研发能够同时净化多种真菌毒素的免疫磁珠,提高免疫磁珠的净化效率,降低检测成本,制定相关标准,使其得到广泛的应用。