黔西南州地方香蕉种质资源遗传多样性ISSR分析

郭计华 和绍翠 洪婷 周端咏 张颢严 曾富飞

黔西南州地方香蕉种质资源遗传多样性ISSR分析

郭计华1和绍翠1洪婷1周端咏1张颢严2曾富飞3

（1. 兴义民族师范学院 贵州兴义 562400；2. 天津医科大学 天津 300000；3. 贵州富亨农业发展有限公司 贵州册亨 552200）

以黔西南州不同地区45份香蕉种质资源为试验材料，利用ISSR标记技术对其遗传多样性进行分析。结果表明：8条引物扩增出83条DNA条带，每个引物平均扩增条带10.4条，多态性比例为96.38%。利用NTsys 2.10e软件构建亲缘关系聚类图，在相似系数为0.673时，将试验材料分为五大类：第Ⅰ类包含7份香蕉材料，第Ⅱ类包含9份香蕉材料，第Ⅲ类包含3份香蕉材料，第Ⅳ类包含22份香蕉材料，第Ⅴ类包含4份香蕉材料。研究为黔西南州香蕉种质资源的保护、开发，利用提供参考。

香蕉；ISSR；黔西南州；遗传多样性

香蕉（spp.）属芭蕉科（Musaceae），芭蕉属（L.）的单子叶植物，是亚热带和热带的“四大果品”（荔枝、香蕉、菠萝、椰子）之一，原产于热带亚热带地区[1-2]。香蕉营养丰富，含有脂肪、蛋白质、钙、磷、铁、钾、糖类、果胶、多种维生素等成分，除供鲜食外，还可以做主食、点心、菜肴等。工业上将香蕉制成香蕉粉、香蕉晶、浓缩香蕉泥、冷冻香蕉片、糖水香蕉、香蕉干等[3]。香蕉喜湿热气候，在土层深，土质疏松、排水良好的地块生长旺盛。黔西南布依族苗族自治州（黔西南州）位于云南、广西、贵州三省（区）结合部，属于亚热带季风湿润气候。这里气候适宜，香蕉种质资源十分丰富，对该区域的香蕉种质资源遗传多样性进行研究十分必要。

简单序列重复区间（Inter simple sequence repeats, ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学的Zietkie­wicz等提出的一种新的微卫星分子标记技术[4]，近年来，因其具有操作简便、快速高效、稳定性好的特点，被广泛应用于亲缘关系的鉴定[5]、指纹图谱建立[6]及遗传多样性分析[7]等方面。彭继庆[8]应用ISSR标记技术，以6个壳菜果种群共69份种质为试验材料分析其种群亲缘关系；李娇婕[9]应用ISSR标记技术对135种木兰科植物资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，比较各个科之间的遗传差异。应东山[10]应用ISSR标记技术为78份芒果构建指纹图谱；杨琴[11]应用ISSR标记技术分析71个石斛种质的遗传多样性，并构建了能区分71个石斛种质的DNA指纹图谱。桂腾琴等[12]应用ISSR标记技术研究了48份梨品种的遗传多样性；王庆军[13]应用ISSR标记技术分析了35份石榴种质的遗传多样性。刘小英等[14]以20份枇杷种质资源为研究对象，采用ISSR分子标记方法进行遗传多样性分析。黔西南州香蕉种质资源极为丰富，野生优良品种在香蕉种质开发、选育和改良中不容忽视。但是近年来，由于黔西南州积极响应国家的脱贫政策，引进了许多“脱贫蕉”，忽略对野生香蕉种质资源的保护，以及野生香蕉种质资源在人为活动的压力下，加之病虫害的侵扰和生态环境恶化等原因，给该区域的香蕉种质资源生存带来很大威胁，局部地区香蕉种质资源正逐步濒危。对此，利用ISSR标记技术，对黔西南州不同地区的45份香蕉种质资源遗传多样性进行分析，以期为该地区的香蕉种质资源保护、开发、利用及鉴定提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的45份香蕉材料采于贵州省黔西南州义龙新区、下午屯街道、则戎镇和望谟县（表1）。选择香蕉无病虫害的新鲜嫩叶，将香蕉样品洗净消毒，放入液氮罐中带回试验室，在‒80℃冰箱保存，用于基因组DNA提取。

表1 四十五份香蕉种质材料信息

注：45份香蕉种质基因型根据黄秉智等（2006）编制的《香蕉种质资源描述规范和数据标准》为分类依据。

1.2 方法

用购于北京六合华大基因科技有限公司的试剂盒提取45份香蕉种质的基因组DNA。

ISSR引物根据已公布序列随机挑选合成。从51条引物中筛选出条带清晰、重复性好（部分引物筛选结果见图1）的8条引物（表2），用于后续试验。PCR反应体系为25mL，其中12.5mL的Mix，1mL模板DNA（0.25mmol/L，70 ng），最后用ddH2O稀释至25mL。PCR扩增程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s；55℃ 40 s；72℃ 10 min；34次循环；72℃延伸10 min，10℃保温。

图1 部分引物筛选结果

表2 引物筛选序列

2 结果与分析

2.1 香蕉基因组DNA的电泳检测

取5mL的香蕉基因组总DNA样品，加入1mL的上样缓冲液，混匀，利用0.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。电压110 V，30 min。电泳结束后，将其置于凝胶成像系统下观察，以检测所提取香蕉基因组DNA的完整性及纯度，部分香蕉基因组DNA检测结果见图2。

2.2 ISSR-PCR扩增结果检测与分析

用0.5%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，并在凝胶成像仪中拍照保存（UBC840、842、843、844、846扩增结果见图3～7。）扩增结果显示，扩增片段长度均在200～2 000 bp，8条引物共检测到83条DNA条带，每个引物平均扩增条带10.4条，多态性比例为96.38%。

图3 引物840扩增结果检测图

图4 引物842扩增结果检测图

2.3 四十五份香蕉种质的UPGMA聚类分析

试验采用凝胶电泳图谱分析软件和人工计数相结合，把每个引物扩增条带进行统计分析，按照相同迁移位置上无条带赋值为0，有条带赋值为1，分别统计每个引物扩增的ISSR多态性位点，由“01”组成的ISSR表型数据矩阵表。利用NTsys 2.10e软件计算香蕉种质间的遗传相似性系数（Sg:Genetic similarity），通过非加权算术平均数聚类法（UPGMA），建立45份香蕉种质资源遗传关系聚类图（图8）。在相似系数为0.673时，将45份香蕉种质分为五大类：第Ⅰ类包含7份香蕉种质，第Ⅱ类包含9份香蕉种质，第Ⅲ类包含3份香蕉种质，第Ⅳ类包含22份香蕉种质，第Ⅴ类包含4份香蕉种质。将第Ⅰ类划分为2个亚类：第一亚类中包含望谟1、2、3、4号，其中，4号与1、2、3号亲缘关系较远；第二亚类中包含义龙新区1号和下五屯街道1、2号。将第Ⅱ类分为3个亚类：第一亚类中包含义龙新区3、4号和则戎1、3号；第二亚类中包含则戎2号和下五屯街道3、4号；第三亚类包含则戎4号和望谟5号。第Ⅲ类3份香蕉种质为义龙新区2、6号和望谟6号。将第Ⅳ类划分为2个亚类：第一亚类包含21份香蕉种质，将其划分为4个小类，第一小类包含望谟7、8、9、11、12、13、14、18、19、20号，第二小类包含望谟16、17号，第三小类仅有一份香蕉种质为望谟15号，第四小类包含义龙新区7号，则戎6、7、8号，下五屯街道7、8、9号和望谟21号；第二亚类仅包含1份香蕉种质，望谟10号。第Ⅴ类包含义龙新区5号，则戎5号和下五屯街道5、6号。则戎7号和8号在相似系数为0.98时归为一类，望谟2号和3号在相似系数为0.96时归为一类，则戎4号和望谟5号在相似系数为0.94时归为一类，可能存在同物异名的现象，其中望谟10号香蕉种质与其余香蕉种质亲缘关系最远。

图5 引物843扩增结果检测图

图6 引物844扩增结果检测图

图7 引物846扩增结果检测图

3 结论

用筛选出的8条引物对45份香蕉种质资源进行ISSR-PCR扩增，共扩增出83条DNA条带，多态性比例为96.38%。利用NTsys 2.10e 软件对黔西南州4个地区的45份香蕉种质进行聚类分析，可将其分为五大类。聚类结果表明，除望谟10号香蕉种质外，可将其余香蕉种质聚在一起。因此，望谟10号可能为最古老的香蕉种质，与其余香蕉种质亲缘关系最远。则戎镇10号和11号，望谟2号和3号以及则戎镇4号和望谟5号，这可能存在同物异名的现象。研究结果表明，采用ISSR技术可以将香蕉遗传背景和形态特征不同的香蕉种质进行有效分类。

[1] 廖可. 健康水果话香蕉[J]. 绿化与生活, 2011(4): 1.

[2] 只佳增, 杜浩, 周劲松, 等.云南特色香蕉新品种主要农艺性状及产量比较[J]. 热带农业科学, 2022, 42(4): 22-27.

[3] 张玉祥. 古老的水果香蕉[J]. 服务科技, 2001(1): 38.

[4] Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].  Genomics, 1994, 20(2): 176-183.

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[9] 李娇婕. 基于ISSR标记对木兰科植物亲缘关系分析[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2019.

[10] 应东山. 78份杧果种质指纹图谱构建[D]. 海口: 海南大学, 2012.

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[12] 桂腾琴, 郭计华, 王颖娟, 等. 贵州地方梨品种资源遗传多样性ISSR分析[J]. 果树学报, 2017, 34(9): 1 076-1 083.

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[14] 刘小英, 蔡益航, 吴碧君, 等. 二十个枇杷品种(系)ISSR标记的遗传多样性分析[J]. 热带农业科学, 2022, 42(11): 58-63.

ISSR Analysis of Genetic Diversity of Local Banana Germplasm Resources in Qianxi'nan Prefecture

GUO Jihua1HE Shaocui1HONG Ting1ZHOU Duanyong1ZHANG Haoyan2ZENG Fufei3

(1. Minzu Normal University of Xingyi, Xingyi, Guizhou 562400, China; 2. Tianjin Medical University, Tianjin 300000, China; 3. Guizhou Fuheng Agricultural Development Co., Ltd., Ceheng, Guizhou 552200, China)

Genetic diversity of 45 banana germplasm resources from different regions of Qianxi'nan Prefecture was analyzed by ISSR markers. The results showed that 83 DNA bands were amplified by eight primers, with an average of 10.4 per primer, and the proportion of polymorphism was 96.38%. Using the NTsys 2.10e software to construct the phylogenetic cluster diagram, the experimental materials were divided into five categories when the similarity coefficient was 0.673: Class Ⅰ contained seven banana materials, Class Ⅱ included nine banana materials, class Ⅲ had three banana materials and class Ⅳ contained 22 banana materials, and Class Ⅴ contained four banana materials. This study provides some reference for the protection, development, and utilization of banana germplasm resources in Qianxi'nan Prefecture.

banana; ISSR; Qianxi'nan Prefecture; genetic diversity

S668.1

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2023.09.009

2022-12-20；

2023-03-02

2022年国家级大学生创新创业项目《黔西南百香果种质资源遗传多样性ISSR分析》（No.202210666282）；贵州省“2011协同创新中心”（No.黔教合协同创新字[2015]08）；贵州省高校创新人才团队（No.黔教合人才团队字[2013]30）。

郭计华（1984—），男，硕士，高级试验师，主要研究方向为果树种质资源及遗传多样性，E-mail：6020183@qq.com。

（责任编辑 龙娅丽）