外泌体在药物递送系统中的研究进展

皮桐昊，刘瑞琦，贾佳佳，王东凯

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

药物在体内的转运过程极其复杂，多数药物载体会在转运过程中由于生物不相容性而导致药物的生物利用度降低。并且在现阶段的药物治疗中，多数药物均需要载体进行递送以发挥良好的治疗效果，而传统的药物递送载体均以外源性载体为主，虽然现阶段的纳米级的药物载体在一定程度上优于传统的药物递送载体，但将其投入临床应用和其在体内的转运过程仍然面临着两大问题：①安全性——纳米载体材料的毒性；②在体内是否会造成异质性——被网状内皮系统（reticuloendothelial system,RES）或单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocyte system,MPS）识别捕获而被快速清除[1]。尽管现阶段可通过聚乙二醇（PEG）对纳米粒子进行表面改性，赋予其“隐形”的特性，抑制血液中的调理素蛋白对纳米载体的识别，减少了非特异性血清吸附，减少了RES 的吞噬，进而使得纳米载体可以在体内具有较长的循环时间，为靶向传递提供更多的机会；但由于PEG 层本身具有高度的亲水性，在赋予纳米载体“隐形”的同时，也阻碍了纳米药物载体与细胞膜之间进行相互作用，会导致药物的释放不理想。并且，近年来有研究表明，纳米载体也具有一定的免疫原性[2-4]，会引起机体的免疫应答，仍然无法从根本上解决上述两大问题，适用范围受到很大的限制。

与人工合成的纳米级药物载体相比，外泌体作为天然的内源性物质，首先就具有很好的生物相容性，具有极低的免疫原性，并且毒性极小，可以从根本上解决上述的两大问题。此外，外泌体在结构上与单层脂质体相似，在脂质体给药系统中，疏水性药物分布在双分子层内，亲水性药物分布在管腔内[5]。根据这种相似性，预计外泌体药物递送系统将表现出与脂质体相似的特征。通过仔细筛选外泌体的来源，可以作为一种高度特异性的药物递送系统，同时，作为天然的药物载体来包载多种药物[6]。近年来，已经有一些案例证明了临床前使用外泌体作为药物递送系统在多种治疗应用中的成功。例如，研究发现利用外泌体的包囊载药，姜黄素的溶解性、稳定性和抗炎性都得到了提升。此外，外泌体制剂在保护小鼠免受脂多糖攻击方面优于脂质体制剂[7]。由此可见，外泌体确实是一种理想的药物递送载体，具有很高的研究价值和极其广阔的应用前景。

1 外泌体

1.1 外泌体及其基本来源

刚发现外泌体时，这种比多泡体还要小的细胞外囊泡被视为细胞外排出的代谢垃圾[8]，但随着对这种细胞外囊泡不断地深入研究，发现这种细胞外囊泡在细胞之间的通讯交流中发挥着极其重要的作用[9]。在这种细胞外囊泡的形成过程中，多种生物分子被包裹在内腔或者脂质双分子层内，从而促进该囊泡的多种功能[10]。该细胞外囊泡就是于 1987 年被 Johnstone 等[11]命名的外泌体。

外泌体是一种由活细胞产生的具有脂质双分子层的纳米级的细胞外囊泡，可以看作为一个内源性的“纳米球”，其直径在 30～100 nm。外泌体具有脂质双分子层结构，由胆固醇、鞘磷脂和磷酸甘油酯等成分共同组成，在其脂质双分子层的表面附着有粘附分子、主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）、大量的特定蛋白质，包括四跨膜蛋白、热休克蛋白等等和各种特定的配体（CD9、CD63、CD81 等）。除此以外，在外泌体的内腔中还携带各种生物分子，包括核酸、某些酶类、蛋白分子、细胞代谢物等，例如信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）、微小核糖核酸（micro ribonucleic acid,miRNA）、脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid,DNA）和长链非编码核糖核酸（Longnon-coding ribonucleic acid,LncRNA）等，如图1 所示[12]。

Fig.1 Structure schematic of exosomes[12]图1 外泌体的结构图[12]

外泌体的形成过程可以大致分为以下三步：①细胞膜通过内吞作用向内凹陷形成囊泡。②囊泡进一步形成多泡体，多泡体内包含细胞质内容物和蛋白质。此时，多泡体有两种选择路径，其一是与溶酶体结合，将内容物和蛋白质降解，另一种是③多泡体向细胞膜移动，并与细胞膜融合，将胞内囊泡释放到细胞外，这个被释放到细胞外的囊泡就是外泌体，这个过程也是外泌体的释放过程（见图2[13]）。多泡体经细胞膜被释放到供体细胞外之后，形成外泌体，随之被附近的细胞或者是其他远处的受体细胞所吸收，进而对受体细胞的生命活动产生影响。

Fig.2 The formation process of exosomes[13]图2 外泌体的形成过程[13]

外泌体的获取来源较为丰富、广泛，无论在正常生理状态下，还是在病理状态下，机体内几乎所有的细胞都可以分泌产生外泌体，例如免疫细胞、间充质干细胞等。外泌体可以被视为一种特异性分泌的膜泡,是细胞与细胞之间进行物质交换和信息交流的一种重要媒介。

1.2 外泌体作为药物递送载体的优势

与人工合成的药物载体相比较，外泌体作为药物递送载体具有以下优势：①外泌体为内源性物质，具有极低的免疫原性和良好的生物相容性，不会被内皮网状系统和单核吞噬细胞系统识别捕获并快速清除。②具有很好的生物稳定性，可使药物的半衰期增加。相关研究表明，即使暴露在炎症环境下，外泌体仍会对药物提供保护，并具有较长的循环时间[14]。并且值得注意的是，利用 PEG 对外泌体进行表面修饰，利用“隐身”特性延缓了被 RES 的快速清除，可以显著提高外泌体的循环时间。相关研究表明，修饰后的外泌体体内循环时间可达到 60 min 以上[15]。③来源广泛，体内多种细胞在正常生理状态和病理状态下均可产生[16]，且存在多种分离提取的方法。④属于天然的纳米级药物递送载体。⑤可包载的药物种类多，特别是可以包载生物活性材料,包括DNA、RNA 和蛋白质等[12。⑥外泌体可以通过绝大多数的生物膜系统发挥作用,包括血脑屏障在内[17]。⑦相较于细胞疗法，外泌体更易储存[18]。⑧外泌体具有肿瘤靶向性以及其他特定的靶向性。大量研究数据显示，外泌体也同其他纳米载体（尺寸 ≤ 100 nm）一样遵循增强渗透和保留效应（enhanced permeability and retention effect,EPR）在肿瘤部位达到靶向聚集[16]；另外一些研究也表明，特定来源的外泌体具有内在的靶向性。例如，由中枢神经细胞产生的外泌体可靶向聚集到特定的神经元；由缺氧肿瘤细胞产生的外泌体可向缺氧肿瘤部位靶向聚集[19-20]。⑨无异倍体性风险[21]，即不会造成使用者的染色体数目不完整。⑩作为内源性物质，其毒性可以忽略。相较于无机材料合成的纳米载体，不会由于其不可降解性而存在潜在的毒性积累，大大降低了安全隐患[22-23]。综上所述，外泌体是理想的药物递送载体[24]。

2 外泌体的获取方法和载药方法

2.1 外泌体的获取方法

外泌体虽然是理想的药物递送载体，但是其分离提取却存在一定的难度。如何在分离提取外泌体的过程中，同时保证其含量、生物活性和结构的完整性是目前需要面临的三个最大挑战。因为到目前为止，还并不存在一种最优的分离提取方法可以同时解决上述所有问题。

迄今为止，用来分离提取外泌体的方法存在很多种，包括超速离心法、梯度密度离心法、分子排阻色谱法色谱、超滤离心法、聚合物沉淀法以及商业化的试剂盒等，但是每一种方法都存在各自的局限性。目前，最常用的外泌体分离提取方法是超速离心法，也被称为外泌体分离提取的“金标准”[25]。该方法的原理是根据外泌体的尺寸大小，通过超速离心将外泌体分离提取的一种分离提取技术。但是，该方法的局限性在于需要多次进行离心处理，这就需要耗费大量的时间，并且需要的样品量较大。同时需要注意的是，超速离心可能会影响到外泌体生物结构的完整性，导致获得的外泌体含量降低[26]或者生物膜固有特性的改变。不仅如此，该方法还会使得外泌体发生聚集或者受到其他细胞碎片、微粒的干扰和污染[27]。虽然该方法被称为外泌体分离提取的金标准，但就客观而言，该方法依然是有很大的局限性。有研究表明，分离提取所得的外泌体的含量和纯度也与分离提取的过程方法有着一定的联系。表1 总结了目前分离提取外泌体的方法及各种方法的优势和局限性[28-33]。

Table 1 Exosome extraction techniques,methods,advantages and disadvantages[28-33]表1 外泌体提取技术、方法和优缺点[28-33]

2.2 载药方法

在将外泌体作为药物递送载体投入到临床应用前，存在的又一个关键性的难题是如何将药物准确有效地载入到外泌体之中。目前，外泌体的载药方法分为两大类：被动载药和主动载药。

被动载药的方式是将药物与外泌体或者外泌体的供体细胞共孵育，进而使得药物进入外泌体中，或者是由外泌体供体细胞分泌装载药物的外泌体，被动载药的局限性相对较大，包封率较低，但载药方法简单。

主动载药的方法包括超声法、挤出法、反复冻融法和电穿孔法。其中，超声法外泌体对药物包封率较高，但是该方法可能会导致外泌体的自身聚集，并且对外泌体膜表面的蛋白造成影响[34]；挤出法的药物包封率也同样较高，但是在载药的过程中由于挤压机械力的存在，有可能会对外泌体的生物结构造成破坏，进而对外泌体的脂质双层膜的固有性质产生一定的影响[35]；反复冻融法的条件相对温和，操作较为简单，不易对生物活性物质造成破坏，但是，该方法会导致外泌体对药物的包封率较低，并且会引起外泌体的聚集[36]；电致孔法是指将外泌体置于一定的外电场之中，在外电场的作用下，外泌体表面会形成若干小孔，这种小孔具有恢复为完整生物膜的倾向，进而将药物包载于外泌体中。该方法的优点在于其方法参数具有可控性，这就使得人工干预更加方便，该方法是目前最具应用前景的载药方法。然而，据相关研究发现，该方法的缺点是容易引起外泌体自身的聚集，但幸运的是该载药方法中的外泌体自身聚集是可逆转的，可以通过不断地进行参数的优化和海藻糖脉冲介质来有效地减少这种问题的发生[37]。此外，还出现了一种极其新颖的载药方法——通过一种特殊的光学可逆的蛋白质-蛋白质相互作用，进而将蛋白质装载到外泌体之中。该方法克服了传统方法的局限性，距离理想的载药方法又近了一步。表2 介绍了一些外泌体药物装载方法和适用药物类型。

Table 2 Exosome drug loading methods and applicable drug types表2 外泌体药物装载方法和适用药物类型

3 外泌体在作为药物递送系统载体的应用进展

3.1 外泌体作为药物递送载体在中枢神经系统疾病中的应用

血脑屏障作为控制各种物质在外周血液循环系统和中枢神经系统（central nervous system,CNS）之间的通过的一种动态界面，有效地保护了中枢神经系统，防止病原体、神经毒素血浆成分和血细胞进入到大脑[38-41]。但也正是由于血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的存在，多数通过血液循环系统要进入脑内进行治疗或者进行疾病预防的药物会受到阻碍，以至于对疾病的治疗和预防产生了极大的阻碍。但外泌体作为一种内源型的物质可以穿透血脑屏障，进入脑内，为药物的脑内递送提供了机会。

就目前而言，药物的脑部递送载体主要有脂质体和胶束。脂质体目前被广泛用于脑部的药物递送，并且，其也同样具有较好的生物相容性[42]，但脂质体的稳定性较差，同时，对其进行表面修饰的可用分子较少，使得脂质体在脑部的药物递送受到了限制[23]；而胶束的结构较为特殊，对于亲水性药物的脑部递送，存在着一定的限制。相对于以上两种载体，外泌体并不存在上述的限制，为药物的脑部递送拓展了一条新的方向。

虽然外泌体作为递送载体可以跨越血脑屏障转运药物或内容物到达大脑，但天然的外泌体靶向性并不强[43]，所以，需要对其进行改造以得到工程外泌体——使用特性的表面分子对天然外泌体的脂质双分子层进行表面修饰或者使天然外泌体装载特定的内容物[44]；经此可以大大提升外泌体的靶向性。通常，前者的改造方法应用价值较高，该方法不仅可以有效地包载治疗药物，还可以保留原外泌体的固有特性，应用前景极其广阔。

有研究表明，将过氧化氢酶装载到外泌体中，可成功穿透血脑屏障进入大脑，进而改善帕金森病的疾病状态[45]。另外，Alvarez-Erviti 等[46]构建了编码溶酶体相关膜糖蛋白2b（Lamp2b）的质粒，并将其转染到树突状细胞（dendritic cell,DC）细胞中,发现获得的外泌体通过膜上的 Lamp2b与神经元特异性狂犬病病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein,RVG）肽融合强烈，经此工程改造的细胞可分泌带有 RVG 肽的外泌体[47](见图3[48])。研究发现，在小鼠模型中，该外泌体装载的siRNA 可以有效地被递送到大脑；并且该 RVG 肽通过与烟碱乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor,nAChR）相结合，可以达到选择性地靶向到达神经元细胞和脑内皮细胞[49]。

Fig.3 Engineering modification of exosomes[48]图3 外泌体的工程改造[48]

3.1.1 外泌体在 CNS 退行性疾病治疗中的应用

Izco 等[50]以 RVG 来源的外泌体为载体，通过电穿孔的方法，将短发夹核糖核酸（short hairpin RNA,shRNA）包载进外泌体之中，对帕金森病症（Parkinson’s disease,PD）的小鼠进行给药。发现 PD 小鼠的大脑中，降低了α-突触核蛋白的聚集和多巴胺能神经元的损伤。Haney等[51]还发现，将过氧化氢酶加载到外泌体之中，对 PD 体内外模型具有显著的神经保护作用。

3.1.2 外泌体在脑血管疾病治疗中的应用

Tian 等[52]通过构建短暂性大脑中动脉闭塞小鼠模型，验证了以骨髓间充质干细胞为供体细胞，利用环(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-D-酪氨酸-赖氨酸)肽[cyclo(arginine-glycineaspartate-Dtyrosine-lysine)peptide,c(RGDyK)]修饰的外泌体，可以有效包载姜黄素治疗大脑缺血，减低缺血性脑损伤区域的炎症反应和细胞凋亡。

Zhang 等[53]通过将 c(RGDyK)和骨髓间充质干细胞来源的外泌体进行偶联，再将经过胆固醇修饰的 miRNA-210 负载至该外泌体，发现该外泌体可以促进脑部血管生成。

3.2 外泌体作为药物递送载体在心血管疾病中的应用

心血管疾病作为全球人类健康的第一杀手，有很高的致死率。在体内的多种生理过程和病理过程均有外泌体的参与，其不仅可以作为心血管疾病诊断的标志物[54]，而且还可以作为天然的药物递送载体，为心血管疾病提供治疗手段。但是仅仅以天然外泌体作为药物递送载体具有一定的局限性，限制了治疗作用[55]。通过构建满足某种需求的外泌体可以打破这种局限性，将治疗效果最大化。可以通过某些特定方式来完成外泌体递送载体的构建，一般可以分为基因修饰和化学修饰两种方法[56]。

基因修饰即对目标外泌体的供体细胞进行基因修饰。对该供体细胞进行基因修饰使其可以表达目标靶向肽，其产生的外泌体也可以表达靶向肽[55]。这种方式构建的功能化外泌体的稳定性得到了较大提高，但耗时、耗资，技术要求相对较高。在这里需要提到的是，机体内可产生外泌体的细胞有很多种，不同细胞所产生的外泌体携带内容物的丰富性存在一定差异。在进行基因修饰之前，可通过所需外泌体的表面标志物的区别，识别其来源[56]，并筛选出合适的供体细胞。

化学修饰即对目标外泌体直接进行表面修饰。一般常用来修饰的化学基团有疏水配体或脂质类配体和4-戊酸基团。在疏水相互作用下，疏水配体或脂质类配体可以自发主动地插入到外泌体的脂质双分子层之中，进而完成表面修饰[57-58]；4-戊酸基团对外泌体的表面修饰分为两步，外泌体的氨基和4-戊酸的羧基发生偶联反应（碳二亚胺偶联反应），之后通过点击化学反应（铜催化的叠氮-炔烃 Husigenhuan 加成反应）再与靶向肽连接，完成表面修饰[59]。

相较于基因修饰，化学修饰方法的优点在于可在体外完成修饰[56]，技术操作相对而言简单。相较于传统的缀和技术，以上两种反应均可在水溶液中进行，并且具有相容性、选择性和专一性高的优势[59]。这些优势为外泌体的化学修饰和临床应用提供了坚实的基础。但由于化学修饰是对外泌体膜表面进行改造，即靶向肽或者其他基团与外泌体膜结合，这可能会对外泌体膜的固有特征产生影响[56]。

值得注意的是，在化学修饰中用到的靶向肽，均需要满足以下条件：对整合蛋白αvβ3 具有高度亲和力，同时必须是含有精氨酸—天冬氨酸序列的环状多肽，即心肌细胞特异性靶向肽和心肌缺血靶向肽[55,58,60]。有相关研究[55]表明，采用靶向肽修饰的外泌体有效地提升了其对心肌缺血区域的靶向性，进而提高了治疗效果。

3.2.1 外泌体在治疗心肌梗死疾病中的应用

Huang 等[61]以脂肪干细胞为供体细胞，使其表达沉默信息调节因子 1 的外泌体。将其给予急性心肌梗死的患者应用。发现该外泌体可以缩小心肌梗死的面积区域，促进血管生成，减轻炎症的反应。有相关研究进行了如下实验，用心肌缺血靶向肽对外泌体进行化学修饰，并应用于心肌梗死的小鼠，发现小鼠左心室射血分数提高显著[55]。

3.2.2 外泌体在治疗心肌缺血疾病中的应用

Cui 等[62]已经证实，以脂肪间充质干细胞为供体细胞，其表达出的外泌体对心肌缺血区域的细胞具有保护作用；并且，其他干细胞，如多能干细胞、胚胎干细胞等分泌产生的外泌体对损伤的心肌细胞还具有一定的修复作用。另外值得注意的是，心肌细胞分泌产生的外泌体对已经损伤的心肌细胞也有一定的修复作用[63-64]。

Ong 等[65]将缺氧诱导因子 1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）与心脏祖细胞共同孵育，使细胞过度表达 HIF-1，分泌出含有丰富 miR-126 和 miR-210 的外泌体；对该外泌体进行提取纯化后，应用于心肌缺血的小鼠，发现该外泌体对缺血性心肌提供了保护作用。

4 外泌体作为药物载体的应用

目前，外泌体作为药物载体的应用已经有了很多的实例，无论是供体细胞的多样性，还是递送物质的多样性，均显示出了较为成熟的外泌体应用技术。并且，在癌症、感染性疾病的适应症上有所突破。外泌体作为药物载体的应用见表3。

Table 3 Application of exosomes as drug carriers表3 外泌体作为药物载体的应用

5 挑战及展望

外泌体作为内源性的“纳米球”，在各个方面都显示出其作为药物递送载体的优势和潜力。无论是外泌体极低的免疫原性和毒性，亦或是良好的生物相容性、内在的靶向性和稳定性，都彰显着外泌体载药系统的天然优势和潜力，为各种疾病的治疗带来了新的曙光。虽然，近些年对外泌体载药的研究增多，并且，有很多研究证明了外泌体载药系统的潜力和可行性，但是就目前而言，现阶段对外泌体的研究还是不够全面的，我们对外泌体的了解或许是只是冰山一角，距离外泌体载药系统实现真正的临床应用，我们还需面临着许多的巨大挑战。

目前，最大的挑战之一是外泌体载药在生物体内非特异性的体内分布。相关研究显示：由某些特定供体细胞分泌产生的外泌体，即使未经表面修饰，相对于传统的药物载体而言，也具有着某些器官的内在的特定的靶向性，例如以 M1 极化的巨噬细胞为供体细胞，所分泌的外泌体对肿瘤组织有显著的内在靶向性[77]。

并且，目前，对外泌体的分离提取也存在难题，缺少一种理想的分离提取技术可以同时保证外泌体的含量、结构完整性和纯度。现阶段的分离提取技术也面临着大规模量产的技术难关。

其次，是载药方法，增加外泌体的药物包载量也是限制其应用的一点；并且，现阶段如何将大核酸加载到外泌体中还是一个技术难点[78]。

再者，现阶段对外泌体的非临床研究和临床研究存在差异，这种差异也存在于实验动物模型和人体之间[79]，某些外泌体的靶向性在进入人体后是否还有其他的预期效果，这一点有待深入研究。

最后，对于外泌体载药递送系统，需要权衡其各个方面的特征，综合考虑不同来源的外泌体在治疗中的局限性和优势，更需要考虑到药物、外泌体和治疗部位的相互作用，调整策略以确保其具有针对性[80]。

尽管目前我们对外泌体药物递送系统的研究还停留在初期，但我坚信，外泌体药物递送系统的临床应用就在不远的明天。