Sestrin2在缺血再灌注损伤中作用的研究进展

罗杰，廖师师，潘锐，陈榕，孟庆涛

武汉大学人民医院麻醉科，武汉430060

缺血再灌注（IR）损伤常见于围手术期，如严重感染、创伤、休克、肠梗阻、肠系膜动脉栓塞、腹主动脉瘤手术、体外循环手术、肝肾移植等，其发病率和病死率较高［1］。IR亦可造成肠道局部损伤，改变肠黏膜屏障功能，导致肠内细菌的内毒素和自由基迁移至肠外器官，从而引发多器官功能障碍甚至衰竭［2-3］。目前，IR发病机制尚未完全阐明，其病理机制主要包括内质网应激、线粒体自噬、自身免疫反应、细胞死亡、细胞凋亡等［4］。近来研究发现，Sestrin2是一种新型的应激诱导蛋白，已被证明具有两个重要功能：C末端结构域抑制雷帕霉素复合物1（mTORC1），N末端结构域抑制氧化应激，这两种功能对于预防和治疗心血管疾病至关重要，包括IR损伤和心肌细胞肥大［5］。Sestrin2表达在炎症反应期间明显增加，以预防氧化应激并限制进行性器官损伤。Sestrin2基因的敲除，会导致一系列氧化应激损伤、更严重的炎症反应和疾病恶化［6］。越来越多的证据表明，Sestrin2在疾病发病中起重要作用［7-8］。Sestrin2是一种保守的抗氧化剂、代谢调节因子，可被多种损伤所诱导，包括氧化应激、内质网应激、自噬、DNA损伤、缺氧等。在哺乳动物中，Sestrin2广泛存在于多种组织细胞中，如神经细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等。Sestrin2增强表达主要通过多种转录因子激活介导，包括p53、活化转录因子4 （ATF4）、激活蛋白1 （AP-1）和CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）。Sestrin2 在N端结构域的一个小区域，是一种活性烷基氢过氧化物还原酶，此功能与一个由反应性Cys125和质子解离系统组成的螺旋-旋转-螺旋基序有关［9］。Sestrin2和GATOR2间的相互作用依赖于DD基序，该基序由环中两个相邻的Asp406和Asp407残基组成［9］。现就Sestrin2在IR损伤中作用的研究进展综述如下。

1 Sestrin2参与调控内质网应激反应

内质网是细胞内最重要的细胞器之一，参与一系列细胞的生理功能，错误折叠蛋白在内质网的积累引发内质网应激（ERS）反应，称为未折叠蛋白反应（UPR）［10］。内质网应激诱导细胞凋亡主要通过蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）介导的C/EBP同源蛋白（CHOP）途径、JNK途径，活化转录因子6（ATF6）这3种跨ER膜蛋白开启信号转导途径所介导。研究表明，PERK是ERS的主要整合者，并且PERK活性的特定调节可影响ERS诱导的细胞凋亡［4］。已有研究表明，肠IR损伤会在小肠细胞中诱导内质网应激反应，表现为内质网应激因子蛋白（葡萄糖调节蛋白78，GRP78）、PERK及与ERS相关的凋亡分子CHOP表达上调及其下游BcL-2表达下调，Bax表达上调［11］。研究发现，Sestrin2是由ERS激活的转录因子CCAAT-增强子结合蛋白β诱导的。一旦诱导，Sestrin2通过抑制雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点而停止蛋白质合成，从而减弱ERS［12］。另外，在小鼠脓毒血症模型中，研究发现Sestrin2能通过抑制内质网（ER）应激（ERS）相关核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）介导的ASC pyroposome形成和Caspase-1（CASP-1）活化，减少脾DCs的gasdermin D依赖性焦烧。此外，Sestrin2缺陷通过加剧PERK-ATF4-CHOP信号通路诱导NLRP3/ASC/CASP-1依赖性焦烧和促炎细胞因子的产生，导致脓毒症小鼠病死率增加，抑制ERS可逆转这一趋势［13］。在白细胞介素-1β诱导髓核细胞（NP细胞）衰老和凋亡，从而导致椎间盘退行性变（IVDD）的模型中，研究发现，Eif2ak3/Eif2ak4-eIF2α-Atf4信号通路激活了Sestrin2，Atf4是Sestrin2的上游分子，Atf4基因的沉默可降低Sestrin2的mRNA水平和Sestrin2蛋白表达，Sestrin2的沉默降低了烟酰胺核苷对NP细胞的保护作用［14］。目前没有Sestrin2在肠IR损伤的相关研究。Sestrin2在细胞内质网中存在，其表达变化与细胞内质网应激反应密切相关。内质网应激通过激活Sestrin2及其下游信号通路，影响细胞骨架和细胞运动，从而导致一系列生理病理改变。因此，研究Sestrin2及其下游信号通路在ERS发生过程中的作用有重要意义。随着对Sestrin2功能认识的加深，将会为其在各种疾病中的作用提供新的见解，进而开发出具有治疗作用的药物。

2 Sestrin2促进线粒体自噬

线粒体通过氧化磷酸化在细胞供能中起核心作用。线粒体的其他功能包括脂质合成、信号转导和钙稳态维持。然而，线粒体也是活性氧（ROS）的主要来源，并通过释放促凋亡因子细胞色素C来触发细胞凋亡。线粒体自噬，即通过选择性形式降解，是一种从酵母到人类保守的基本机制，参与了线粒体的质量和数量控制。线粒体自噬通过特定的线粒体外膜受体与线粒体表面蛋白质结合的泛素分子促进，导致线粒体周围自噬小体的形成。线粒体自噬介导的消除在早期胚胎发育、细胞分化、炎症和凋亡等过程中发挥重要作用。功能失调的线粒体，能产生ROS和诱导细胞死亡，将被自噬识别和清除。自噬通常是由各种压力因素导致，如营养不足、缺氧、细胞内ROS、氧化应激和化学药物等［14］。有研究发现，在人骨肉瘤细胞模型小鼠中，Sestrin2通过PERK-eIF2α-CHOP途径抑制mTOR来激活自噬，并通过Bcl-2抑制骨肉瘤细胞凋亡，Sestrin2低表达可有效降低化疗后人骨肉瘤细胞的自噬，增加p-mTOR表达，降低Bcl-2表达促进骨肉瘤细胞凋亡，减缓肿瘤进展［15］。另外，有研究发现Sestrin2作为一个新的p53靶基因，参与诱导自噬。在不同的自噬诱导剂处理下，Sestrin2在p53充足的细胞中表达增加，而在p53缺乏的细胞中则无增加，而敲除Sestrin2可减少由营养耗尽、雷帕霉素、锂或毒胡萝卜素引起的自噬。Sestrin2缺失不能影响p53缺陷细胞的自噬，也不能调节重新引入p53缺陷细胞的细胞质p53突变体对自噬的抑制。在p53充足的细胞系中，Sestrin2可作为自噬的积极调节因子［16］。近来，在鱼藤酮诱导的帕金森病模型中，Sestrin2 mRNA和蛋白水平以p53依赖的方式显著上调，沉默Sestrin2抑制自噬，同时增加自噬底物的积累，表现为轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）的下调、p62积累的加剧和AMPK磷酸化的抑制。相反，过表达Sestrin2可增强自噬活性，这可通过增强AMPK和p62的磷酸化或α-synuclein的降解来证明，从而保护细胞免受鱼藤酮细胞毒性损伤。这些结果表明Sestrin2促进线粒体自噬，其机制可能与AMPK磷酸化密切相关［17］。有研究发现，Unc-51-like protein kinase 1 （ULK1）和p62是Sestrin2新的结合伙伴，且Sestrin2与ULK1的C端结构域存在物理联系，从而激活其功能。此外，Sestrin2可与ULK1-Atg13-FIP200复合物相互作用，促进p62磷酸化，从而消除功能失调的线粒体和泛素化蛋白，调节Keap1-Nrf2通路。因此，诱导自噬可增强Sestrin2表达，并与多种自噬相关蛋白相互作用调节自噬活性［18］。此外，有研究发现，在白细胞介素-1β诱导NP细胞衰老和凋亡，从而导致IVDD的模型中，Sestrin2可作为椎间盘退行性病变中线粒体未展开蛋白反应（UPRmt）和线粒体自噬之间的调节因子。UPRmt通过eIF2α-Atf4-Sestrin2信号通路诱导线粒体自噬，减少细胞凋亡，改善NP细胞代谢，从而减轻椎间盘退变。UPRmt和线粒体自噬调节机制的紊乱可能是IVDD的危险因素。UPRmt激动剂烟酰胺核苷具有成为IVDD治疗药物的潜力［14］。Sestrin2与线粒体自噬关系密切，其在慢性炎症引起的衰老和细胞凋亡中发挥重要作用，但我们对Sestrin2在IR损伤所致线粒体自噬的机制知之甚少，随着对Sestrin2功能的深入研究，有望为IR损伤相关的疾病提供新的治疗策略。

3 Sestrin2激活多种信号通路

在缺血缺氧相关疾病中，缺血缺氧导致氧化还原稳态失衡，ROS过度积累，导致细胞功能障碍。Sestrin2被证实与多种缺氧相关疾病有关，如大脑疾病、心肌疾病、呼吸系统疾病等［19］。有研究发现，Sestrin2受p53、缺氧诱导因子-1α和核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）等因素调控，其可通过促进自噬、抑制氧化应激和内质网应激发挥细胞保护作用［20］。在这一保护过程中，激活了多种途径，如AMPK/mTOR途径［21］、Nrf2/Keap1途径［22］、MAPK8/JNK1途径、ERK1/2途径。其中，AMPK/mTOR和Nrf2/Keap1是Sestrin2在缺氧条件下参与的关键途径。HAO等［23］报道，在夹闭肝动脉、门静脉、部分胆管90 min，再灌注6 h的小鼠肝IR损伤模型中，IR组肝脏出现中重度水肿和广泛的肝细胞坏死，血清转氨酶水平和损伤评分均升高，Sestrin2蛋白表达上调。使用齐墩果酸（OA）预处理可降低IR组血清ALT、AST水平。HE染色表明，OA处理后IR组肝组织病理损伤得到改善，对应Suzuki′s（肝损伤评分）降低。与此同时，OA预处理的肝脏IR，上调了Sestrin2、PI3K、Akt和血红素加氧酶-1（HO-1）表达，而给药HO-1抑制剂锌原卟啉（ZnPP）可降低OA对HO-1和Sestrin2表达的影响及OA对IRI的保护作用。该研究证明了Sestrin2作为一种抗氧化蛋白，对肝IR损伤的保护作用，与PI3K/Akt/HO-1信号通路有关，但未对PI3K/Akt和HO-1之间的关系进一步研究；此外，在肝IR损伤中OA诱导Sestrin2表达的机制未完全得到证实。MIGDALIA等［24］报道，在阻断双肾动静脉15 min，再灌注24 h的急性肾损伤老鼠模型中，急性肾缺血再灌注损伤（AKI）上调了Sestrin2蛋白表达，使得肾组织结构和功能恶化，坏死小管百分比和血浆肌酐水平均增加，导致远膈脏器的心肌细胞收缩和舒张功能障碍、心肌细胞损伤和纤维化及心肌细胞线粒体功能障碍，而二甲双胍显著改善了AKI诱导的心功能障碍，特别是对老龄小鼠心脏的收缩期和舒张期功能、纤维化和细胞损伤及线粒体功能的改善。而心肌细胞特异性敲除Sestrin2（cSesn2-/-）的小鼠则不存在此种改变。该研究局限于cSesn2-/-小鼠，Sestrin2基因仍存在于其他类型的细胞中，如内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和免疫细胞等。因此，对全Sestrin2基因敲除的小鼠心肌细胞进行免疫印迹可能会产生不同的结果，有待今后进一步验证。QUAN等［25］报道，在冠状动脉左前降支闭塞的心肌缺血再灌注小鼠模型中，心脏Sestrin2蛋白水平随年龄增长而逐渐降低。与年轻心脏相比，老年心脏的缺血AMPK激活减弱，IR期间，老年心脏AMPK下游葡萄糖摄取和葡萄糖氧化率降低，老龄心肌梗死体积增大。利用Sestrin2 Ab免疫沉淀发现，心脏Sestrin2在缺血期间与AMPK和上游肝脏激酶B1形成复合物。与之相同的是，Sestrin2-ko小鼠心脏IR损伤后，心脏损伤指标明显增大，AMPK活化减弱，而通过冠状动脉输送方法将腺相关病毒Sestrin2注入老年心脏，显著挽救了Sestrin2蛋白水平和老年心脏的缺血耐受性。证实Sestrin2是一种与年龄相关的应激诱导蛋白，通过影响AMPK激活和底物代谢，在缺血损伤的适应性反应中发挥重要作用。对Sestrin2-AMPK信号转导的进一步了解，将会是开发抗衰老相关IR损伤新治疗策略的重要成果。

4 Sestrin2抑制氧化应激

ROS是通过氧化代谢、线粒体的生物学功能和免疫功能在体内不断产生的。生理上的ROS对细胞内外的信号转导至关重要。然而，在氧化应激下，过载的ROS可结合并破坏多数细胞生物分子（脂质、酶、糖、蛋白质、核酸和其他小分子）。氧化应激被认为是某些细胞环境中氧化还原特性的失衡，并在许多疾病发展中发挥关键作用，包括糖尿病、肥胖和心肌损伤［26］。抵抗氧化应激损伤是Sestrin2的重要功能之一。在氧化应激反应中，Sestrin2表达在mRNA和蛋白水平上受到多种转录因子的调控，包括核因子-κB、AP-1、C/EBPb、叉头盒O3和p53［27］。Sestrin2被认为通过两种主要的生物功能来维持氧化代谢的平衡。首先，作为一种抗氧化酶，Sestrin2能直接减少ROS的积累。然后，Sestrin2本身的催化抗氧化活性有限。其次，最近研究表明，Sestrin2抑制ROS的产生，保护细胞抵抗氧化应激，主要原因可能是其调节了几个与氧化应激相关的信号通路：KEAP1/NRF2抗氧化信号通路及AMPK和mTORC1通路。NRF2是一种转录因子，可与抗氧化反应元件（ARE）结合，促进多个抗氧化分子的表达，以保护细胞免受氧化损伤。在生理条件下，NRF2在细胞质中组成性表达。在正常情况下，KEAP1与NRF2结合，阻止NRF2易位到细胞核，促进其泛素化和蛋白酶体降解，并在细胞质中维持低水平的游离NRF2。而在氧化应激下，NRF2从KEAP1中分离并易位到细胞核。NRF2与ARE结合可激活靶基因PRX、SRX、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、血红素加氧酶1和谷胱甘肽过氧化物酶1的转录［28］。而在细胞研究中我们发现，Sestrin2与unc51样激酶1（ULK1）和p62结合形成功能复合物，Sestrin2促进p62的磷酸化，进而促进KEAP1降解和NRF2激活［26］。近来有研究发现，在砷暴露诱导大鼠和原代肝细胞发生氧化应激模型中，Sestrin2/AMPK/ULK1通路的激活，导致溶酶体损伤，最终导致肝细胞坏死，其特征为LC3Ⅱ脂化、p62积累及RIPK1和RIPK3的激活。同样，砷暴露也会损害原代肝细胞的溶酶体功能和自噬，NAC处理后溶酶体功能受损，Leu-peptin处理后溶酶体功能受损加重。而p62 siRNA后原代肝细胞坏死相关指标RIPK1和RIPK3的转录和蛋白表达均下降［29］。YANG等［30］报道，在小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）和小鼠原代皮层神经元细胞缺氧葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）的脑缺血再灌注损伤模型中，损伤诱导了Sestrin2蛋白和POU域2类转录因子2（POU2F2）的表达上调。慢病毒介导的POU2F2敲除小鼠，进一步损伤了MCAO/R诱导的小鼠脑缺血再灌注损伤（CIRI），表现为神经功能缺损增加、脑梗死体积增加和神经元损失。在体内POU2F2的缺乏可通过下调Sestrin2蛋白表达，降低SOD、GSH、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的活性及ROS、脂质ROS、4-羟基壬烯醛和MDA的积累来恶化氧化应激和铁死亡。在体外，敲除POU2F2的初级皮层神经元细胞也表现出更严重的神经元损伤、氧化应激和铁死亡，与此同时降低了Sestrin2表达，加速了氧化应激和铁死亡，进一步加重CIRI。而在小鼠原代皮层神经元细胞中，予以OGD/R处理，过表达Sestrin2可减轻氧化应激和下调POU2F2引起的铁死亡。因此CIRI诱导了POU2F2和Sestrin2的代偿性增加。下调POU2F2可能是通过降低Sestrin2表达，加速氧化应激和铁死亡来加重CIRI。在未来，研究出上调Sestrin2的药物可能为CIRI的治疗机制提供新思路。

综上所述，Sestrin2作为一种新型的抗氧化蛋白，在IR损伤病理生理过程中发挥重要作用，主要通过AMPK/mTOR途径、Nrf2/Keap1途径、MAPK8/JNK1途径、AMPK/PGC-1α途径、ERK1/2等，参与内质网应激、线粒体自噬、缺氧、氧化应激、铁死亡、凋亡、焦亡等，从而发挥保护作用。IR损伤时，上调或激活 Sestrin2可一定程度减轻或改善组织器官的损伤，而上调Sestrin2的药物及其作用疗效需进一步研究与探索。