4 种石斛属花朵挥发性成分GC-MS 分析

张钰莹 ，许 凤 ，曹 桦 ，赵瑞晶 ，李 涵 ，李东徽

（1.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201；2.云南省农业科学院 花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650205）

石斛属（Dendrobium）为兰科植物的第二大属，与卡特兰属（Cattleya）、蝴蝶兰属（Phalaenopsis）和文心兰属（Oncidium）并称为世界四大观赏洋兰［1]，在全世界约有1 500 个原生种［2]，我国有81 个种，云南省有58 个种，居全国第一［3]。花香作为一种重要的观赏性状，不仅可以有效增强植物的观赏特性，还可吸引昆虫，保证繁殖的成功，其正在成为一种重要的观赏性评价指标［4]。

捕获芳香化合物的方法不同获得的挥发性物质存在一定的差异性，目前获取花朵中挥发性物质的方法包括水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、同时蒸馏萃取法、固相微萃取法等［5]。然而有研究发现，通过高温和不同pH 条件萃取处理可能会改变花中原始挥发性成分［6]，固相微萃取作为一种有效的静态顶空采样方法，可富集和分离其他一些分析方法可能无法检测到的低阈值香气成分，能够通过快速简单和无溶剂的方式产生高浓度的提取物，减少植物化合物的分解，最大限度地降低了酶活性，减少成分的损失，已被广泛用于检测植物和食品中挥发性成分［7-8]。

植物花香成分及其生物合成过程极其复杂，不同品种石斛花挥发性成分存在显著差异。FLATH等[9]和JULSRIGIVAL 等[10]从檀香石斛中鉴别出25 种挥发性成分，主要挥发性成分为甲基酮和2-烷基乙酸酯，麝香石斛花的主要芳香化合物为2-十五烷酮。李崇晖等［11]研究发现，鼓槌石斛与细叶石斛的主要香味物质均为3-蒈烯，罗河石斛的主要香味组分为水杨酸甲酯，2-亚甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基-双环[5.2.0]壬烷被鉴定为密花石斛的主要挥发性成分。夏科等［12]研究发现，萜烯类为鼓槌石斛、细叶石斛、流苏石斛、翅萼石斛、翅梗石斛和春石斛的主要赋香成分。王元成等［13-14]研究发现，肿节石斛、棒节石斛和翅梗石斛的主要香气组分以烯类化合物为主，玫瑰石斛的主要香气成分以烯类和烷类化合物为主，报春石斛挥发性成分以酯类为主，主要成分为醋酸辛酯，细叶石斛的特征香气成分为罗勒烯、β-石竹烯和芳樟醇。仇硕等[15]研究发现，烯类物质是影响细茎石斛花香的重要化合物，主要挥发性成分为(1R)-(+)-α 蒎烯。丁灵等[16]测定了秋石斛5 个具香气的品种，结果发现，5 种具香气的秋石斛花朵所含挥发性成分绝大部分都是萜烯类，主要赋香成分为3-蒈烯、芳樟醇、α-可巴烯和α-法尼烯。

本研究选取云南石斛属的4 种石斛，采用固相微萃取-气相色谱-质谱联合技术（SPME-GCMS）进行挥发性成分分析，比较4 种石斛挥发性成分的共性和特异性，确定影响其气味的主要挥发性成分，筛选有价值的香花型石斛资源，为香花型石斛育种提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试4 种带香味的石斛属盛花期花朵，包括报春石斛（Dendrobium primulinum）、美花石斛（Dendrobium loddigesii）、麝香石斛（Dendrobium parishii）和红龙石斛（Dendrobium.Red Dragon）（图1），均采自云南省农业科学院花卉研究所澄江兰花资源圃。

图1 4 种石斛盛花期花部特征Fig.1 Floral characteristics diagram of four Dendrobium species in full flowering stage

1.2 仪器

手动固相微萃取进样器（美国Supelco 公司），65 μm PDMS/DVB 萃取头（美国Supelco 公司），7890B-5977A 气相色谱-质谱仪GC-MS（美国Agilent 公司），BG25 干式恒温器（杭州朗基科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS检测 将SPME萃取头插入GC-MS进样口，250 ℃老化处理52 min，选择生长和开花正常的植株作为采集对象，盛花期花朵大花采2 朵，小花采3 朵，称质量，整朵放入50 mL 广口锥形瓶底部，重复3 次，加入2 μL 0.1%（4.325 μg/μL）癸酸乙酯为内标，将萃取头插入锥形瓶中下部，瓶口用封口膜密封，35 ℃恒温萃取30 min。萃取完成后，取出萃取头，插入GC-MS 进样口，解析30 s 后，进样分析。

色谱条件：色谱柱为HP-5MS 石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：初始温度为40 ℃，接着再以3 ℃/min 升温至80 ℃，继续以5 ℃/min 升温至250 ℃，最后再以250 ℃维持5 min。载气为99.99%的高纯度氦气，隔垫吹扫流量为3.00 mL/min；总流量为9.00 mL/min；柱前压50 kPa，分流比10∶1；3 min 溶剂延迟 。

质谱条件：采用EI 离子源，MS 离子源温度230 ℃，MS 四级杆温度150 ℃，传输线温度250 ℃，电子能量70 eV ，数据采集模式：标准扫描，质量扫描范围为m/z35～450；柱压50 kPa。

1.3.2 花香成分定性与定量分析 按照GC-MS总离子流色谱图，分析各个峰所对应的质谱图，将获得的质谱数据，用MSD ChemStation Data Analysis F.01.03 版本软件，与NIST14.L 所给出的标准物质谱图库进行比对，得出挥发性化合物组分种类，根据离子流峰面积归一化法，计算总挥发物中各组分的相对含量。

以癸酸乙酯为内标，根据挥发物与内标的峰面积对比，计算组分含量。

1.4 数据分析

试验采用SPSS 26.0 软件进行单因素方差分析，采用GraphPad 软件绘制4 种石斛成分差异分析柱形图。

2 结果与分析

2.1 不同石斛盛花期花朵挥发性成分比较

由图2 可知，采用GC-MS 方法，对4 种香花石斛盛花期花朵的挥发性成分进行分析测定，得到挥发性物质的离子流峰图，共鉴定出72 种化合物，分别占各总挥发性成分的98.14%（报春石斛）、99.47%（美花石斛）、99.02%（麝香石斛）、99.70%（红龙石斛）。

图2 4 种石斛盛花期花朵挥发性成分的GC-MS 总离子流Fig.2 GC-MS total ion flow diagram of volatile components in flowers of four Dendrobium species in full flowering stage

从表1 可以看出，石斛的种类不同，其挥发性成分亦不相同，其挥发性成分总含量从大到小依次为美花石斛＞麝香石斛＞红龙石斛＞报春石斛，美花石斛相对总含量高达136.07 μg/g，是麝香石斛的2.5 倍、红龙石斛的7.6 倍、报春石斛的11.4 倍。

表1 4 种石斛属植物花朵的主要挥发性成分及其含量变化Tab.1 Main volatile components and content changes of flowers of four of Dendrobium species

从表1 可以看出，报春石斛中共鉴定出40 种化合物，其中，正丙基环戊烷的相对含量最高（7.65 μg/g），占总含量的64.23%，其次为乙酸苄酯（1.68 μg/g），占总含量的14.11%，其余主要成分包括乙酸叶醇酯、水杨酸异辛酯、乙酸正己酯、苯乙酮等。美花石斛中共鉴定出20 种化合物，其中，环辛烷的相对含量最高（124.52 μg/g），占总含量的91.51%，其余主要成分包括（+）-3-蒈烯，乙酸癸酯等。麝香石斛共鉴定出8 种化合物，其中，2-十五烷酮的相对含量最高（51.47 μg/g），占总含量的94.89%，其余主要成分包括2-十三烷酮、十七烷酮等。红龙石斛中共鉴定出20 种化合物，其中，2-十五烷酮的相对含量最高（11.77 μg/g），占总含量的65.98%，其余主要成分包括2-十三烷酮、1,7-十二碳二烯、油醇等。

4 种石斛的主要赋香成分存在明显的差异，如图3 所示，报春石斛的主要赋香物质为乙酸苄酯、乙酸叶醇酯等；美花石斛的主要赋香成分为（+）-3-蒈烯、苯甲酸辛酯等；麝香石斛和红龙石斛的主要赋香成分大致相同，均含有2-十五烷酮和2-十三烷酮。

图3 4 种石斛主要赋香成分Fig.3 Main fragrance-contributing components of four Dendrobium species

2.2 4 种石斛差异成分分析

4 种石斛盛花期花朵中未见共有的挥发性成分，其中，苯甲酸辛酯、水杨酸异辛酯除在红龙石斛中未发现外，在其余3 种石斛中均有少量存在；仅2-十五烷酮、2-十三烷酮、六甲基环三硅氧烷、（+）-3-蒈烯、乙酸癸酯等少量物质存在于2 种石斛中，其中，2-十五烷酮、2-十三烷酮为麝香石斛和红龙石斛的主要及次要挥发性成分，麝香石斛中2-十五烷酮的相对含量为红龙石斛的4.4 倍，2-十三烷酮在2 种石斛中的相对含量大致相同，分别是麝香石斛1.69 μg/g，红龙石斛1.79 μg/g（图4）。

图4 4 种石斛差异成分分析Fig.4 Analysis of differential components of four Dendrobium species

在4 种石斛中，仅在报春石斛含有的挥发性成分有30 种，其中只有正丙基环戊烷和乙酸苄酯的相对含量在1 μg/g 以上；仅在美花石斛含有的挥发性成分有11 种，其中只有环辛烷、丁酸辛酯、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-十八烷三烯的相对含量在1 μg/g以上；仅在麝香石斛含有的挥发性成分只有1 种，相对含量在1 μg/g 以下；仅在红龙石斛含有的挥发性成分有16 种，其中只有1，7-十二碳二烯相对含量达到1 μg/g 以上（图4）。

2.3 4 种石斛盛花期花朵挥发性成分分析

4 种石斛盛花期花朵共鉴定出72 种化合物，依据化学结构可以分为9 种类型（图5）。其中在报春石斛和美花石斛中含量最高的均为烷类物质，分别占总化合物成分的67.51%和91.51%，其次为酯类化合物，分别占化合物总量的23.51%和4.70%；麝香石斛和红龙石斛中含量最高的均为酮类化合物，分别占化合物总量的99.48%和80.38%。酚类物质仅丁香酚、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚2 种，酸类物质仅香叶酸1 种，均为美花石斛特有物质，3 种物质的总含量占美花石斛挥发物总含量的0.31%。醛类物质仅存在于报春石斛和红龙石斛中，含量均较低。其他类物质只在报春石斛和麝香石斛中发现，其含量均低于0.1 μg/g。

3 讨论

3.1 不同石斛盛花期花朵挥发性成分及含量分析

有研究发现，不同的品种、培养方式、产地、季节变化、环境等因素均会对植物的挥发性成分产生影响[17-21]。颜沛沛等[22]采用静态顶空气相色谱-质谱联用技术测得报春石斛花含量最多的为酯类，主要香味成分为醋酸辛酯，其次为乙酸乙酯。王元成等[13]采用固相微萃取技术从新鲜完整的报春石斛盛花期花朵中共测得61 种香味成分，以酯类和醇类化合物为主，其中对其香味影响最大的物质为醋酸辛酯和正辛醇。袁明焱等[23]采用顶空固相微萃取法从美花石斛中检测出21 种香气成分，发现乙酸-2-乙基己酯的相对含量最高，为主要香味物质，其次要成分1，3，6-辛三烯对花的香气有一定的影响。曹桦等[24]采用固相微萃取法从美花石斛中测得20 种香气成分，以酯类化合物为主，主要挥发性成分为乙酸异辛酯。本研究采用顶空固相微萃取和GC-MS 技术测出报春石斛以正丙基环戊烷为主要挥发性成分，美花石斛以环辛烷为主要挥发性成分，麝香石斛和红龙石斛的主要及次要挥发性成分均为2-十五烷酮和2-十三烷酮，与前人研究存在差异，可能与4 种石斛生长环境不同有关。

3.2 不同石斛盛花期花朵赋香成分分析

不同石斛品种挥发性成分存在一定的差异性，花朵的香味除了受其挥发物含量的影响外，还取决于其香气成分的阈值[25]。根据相关报道，醛类物质由不饱和脂肪酸氧化产生，一般阈值较低，对气味的影响较大，通常表现为果香、青香或脂香；醇类物质香味阈值一般较高，对风味的贡献很小，但存在一些不饱和醇类的香味阈值会较低，对风味影响较大，主要表现为酒香、清香或者类似于金属的气味；酯类和萜烯类的阈值都比较低[26]。本研究中报春石斛气味清香，美花石斛花香淡雅，麝香石斛和红龙石斛香气浓郁。正丙基环戊烷为报春石斛的主要挥发性成分，但烷类物质一般无气味或气味微弱，所以，一般可忽略其香味，乙酸苄酯作为其次要成分有蜂蜜般的甜味并稍带花香和果香[27]，可以认为是报春石斛的主要赋香成分，此外，乙酸叶醇酯具有明显的青草、青叶和强烈的香蕉气息[28]，对报春石斛的花香有一定的贡献。环辛烷作为美花石斛的主要挥发性成分，有一定的樟脑气味，（+）-3-蒈烯具有香甜的气味[29]，对美花石斛的花香贡献最大，另外，乙酸癸酯具有橙子和玫瑰香味以及菠萝的甜味[30]，乙酸辛酯水果香型对美花石斛的花香有一定的贡献。2-十五烷酮为麝香石斛和红龙石斛花朵的主要赋香成分，同时也是重唇石斛的主要挥发性成分[31]，2-十三烷酮作为二者的次要挥发性成分，具有椰子香，对花香有一定的贡献。本研究对云南省4 种石斛花朵的香味物质进行初步研究，结果表明，不同石斛属植物花朵的挥发性成分存在着明显的差异，可为香花型石斛兰育种提供一定的参考。

4 结论

本研究结果表明，4 种石斛盛花期花朵共鉴定获得72 种挥发性物质，主要分为烷类、酮类、酯类、烯类、醇类、醛类、酚类、酸类和其他类等。报春石斛的赋香成分主要包括乙酸苄酯、乙酸叶醇酯；美花石斛的赋香成分主要包括（+）-3-蒈烯、苯甲酸辛酯、丁酸辛酯、乙酸癸酯；麝香石斛的赋香成分主要包括2-十五烷酮、2-十三烷酮、十七烷酮；红龙石斛的赋香成分主要包括2-十五烷酮、2-十三烷酮、1，7-十二碳二烯。