球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂的影响

候梦赏，梁 铖，展 江，秦加敏，邓尚靠，宗德琴，李志国

（1.云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2.福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建 福州 350002）

球囊菌是一种蜜蜂真菌性病害，会导致意大利蜜蜂幼虫患白垩病，球囊菌通过孢子侵染意大利蜜蜂幼虫，进入幼虫肠道后，迅速萌发生长，分泌胞外蛋白酶，破坏幼虫肠道壁与围食膜，侵染后期，球囊菌孢子进入幼虫后肠，菌丝生长穿透体壁，幼虫缩水形成子实体，导致蜂群幼虫大量死亡，严重影响蜂群正常生存[1]。白垩病自首次在欧洲蜂群发现后[2]，迅速传播到美洲、亚洲等地蜂群中，直至在全世界的意大利蜜蜂养殖区都有白垩病的存在[3]。

蜜蜂作为一种社会性昆虫，细胞免疫和体液免疫是其抵御外来致病因子的主要免疫体系，而蜜蜂抗菌肽的分泌更是抵抗致病菌的重要免疫应答模式[4]。研究表明，将1×105个球囊菌孢子接种意大利蜜蜂幼虫后，幼虫肠道抗菌肽基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin均显著上调表达[5]；接种球囊菌后，意大利蜜蜂幼虫在化蛹期死亡率高达76%[6]，未接种球囊菌幼虫组无死亡，球囊菌侵染后对幼虫致死率较高。蜜蜂肠道中有5 种核心菌群，包括革兰氏阳性的乳杆菌属LactobacillusFirm-4 与LactobacillusFirm-5，革兰氏阴性菌的Snodgrassella alvi与Gilliamella apicola，及双歧杆菌的Bifidobacteriumspp[7]。近年来，大量研究表明，肠道菌群对蜜蜂具有重要的生理功能，蜜蜂肠道中存在大量共生菌，与宿主形成互利共生的关系，肠道菌群可以帮助蜜蜂消化代谢花粉，调节肠道生理环境，维护蜜蜂正常发育，参与宿主的免疫调控等[8-10]。

关于球囊菌侵染对意大利蜜蜂的影响研究已有较多报道，如免疫应答[11]、侵染过程[12]、转录组学测定[13]、抗白垩病如SNP 筛选等方向[14]。但这些研究多为球囊菌侵染蜜蜂幼虫的研究，而关于球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂的影响报道较少。而球囊菌孢子是通过意大利蜜蜂成年工蜂传播到幼虫体内的，所以蜂群中意大利蜜蜂成年工蜂体内也含有一定量的球囊菌孢子，意大利蜜蜂成年工蜂作为球囊菌的携带者和传播者。球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂无明显的致病性，但是对意大利蜜蜂个体免疫、肠道菌群及存活率的影响报道尚少。为此，通过球囊菌侵染意大利蜜蜂成年工蜂后，探究意大利蜜蜂成年工蜂个体免疫、发育相关基因的表达，肠道菌群及存活率的变化，以期寻找意大利蜜蜂成年工蜂抵御球囊菌侵染的机制，为白垩病的防治奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所用意大利蜜蜂取自福建农林大学动物科学学院（蜂学学院）实验蜂场，试验蜂群经箱外观察及PCR检测无白垩病发生。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：TaKaRa 公司的PrimeScript ™RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒与SYBR®Premix ExTaq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒；Ambion 公司的RNA Trizol；国药集团化学试剂有限公司的异丙醇、氯仿与无水乙醇等。主要仪器：Thermo Scientific 公司的NanoDrop 2000 型分光光度计；Applied Biosystems 公司的低温高速离心机与梯度PCR 仪；BIORAD 公司的荧光定量PCR仪；上海一恒科学仪器有限公司的恒温恒湿培养箱；上海培清科技有限公司的全自动凝胶成像分析仪JS-690D型。

1.3 纯化球囊菌孢子接种意大利蜜蜂成年工蜂

从患白垩病的蜂群中收集白垩病虫尸，参考关于球囊菌的纯化培养方法[15]，使用次氯酸钠溶液清洗表面的杂菌，虫尸切块置于MY-20 培养基上培养，培养出雪花状的球囊菌菌丝（图1），2 次转接培养获得黑色的球囊菌孢子，收集球囊菌孢子，使用研磨仪充分研磨破壁，获得球囊菌孢子悬浮液，血球计数法统计孢子液浓度。

图1 球囊菌菌丝Fig.1 The mycelium of Ascosphaera apis

在3 个健康蜂群中取3 张成熟意大利蜜蜂子脾，放入恒温培养箱中，标记每天刚出房的1日龄意大利蜜蜂，放入蜂群中饲养至6 日龄，收取12 盒意大利蜜蜂，每盒40 头，在恒温培养箱中饲养。处理组饲喂含球囊菌4×106个/mL的30%蔗糖溶液，对照组饲喂30%蔗糖溶液，供蜜蜂自由取食。处理组意大利蜜蜂连续饲喂3 d 含球囊菌孢子的蔗糖溶液，第4 天起处理组与对照组饲喂同样的不含球囊菌孢子的30%蔗糖溶液。分别收集饲养4 d 与8 d 的意大利蜜蜂中肠与后肠，-80 ℃冰箱保存用以后续试验。

另外收取6 日龄意大利蜜蜂4 盒，对照组与处理组各3盒，处理组意大利蜜蜂连续饲喂3 d含球囊菌孢子4×106个/mL 的30%蔗糖溶液，第4 天以后饲喂30%蔗糖溶液，对照组一直饲喂30%蔗糖溶液，每天更换新鲜蔗糖溶液，记录每天意大利蜜蜂的死亡数量，统计分析球囊菌侵染对成年意大利蜜蜂工蜂存活率的影响。

1.4 RNA提取与荧光定量PCR（qRT-PCR）检测

通过TRIzol 法提取意大利蜜蜂肠道的RNA，测定RNA 浓度后保存于-80 ℃冰箱中。使用TaKaRa公司的PrimeScript ™RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒进行cDNA的合成，在PCR 管中配制反转录反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，总RNA 1.0 μL，无核酸酶ddH2O 6.0 μL。在PCR 仪中42 ℃反应2 min。反应结束后，向反转录反应液中分别加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4 μL，无核酸酶ddH2O 4 μL，共20 μL 体系，反应程序：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。

使用TaKaRa 公司的SYBR®Premix ExTaq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒进行荧光定量PCR 反应。在冰盒上配制反应体系：SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）5 μL，PCR 上游引物、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA 模板1 μL，无核酸酶ddH2O 3.2 μL，共10 μL 反应体系。PCR 反应条件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环；4 ℃保存。

1.5 意大利蜜蜂工蜂中肠与后肠球囊菌含量测定

取1.3 中收集的意大利蜜蜂中肠与后肠，分别提取意大利蜜蜂中肠与后肠的DNA，使用荧光定量PCR 检测意大利蜜蜂中肠与后肠的球囊菌含量。使用TaKaRa 公司的SYBR®Premix ExTaq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒进行球囊菌含量测定，上游引物序列：5′-TCTGGCGGCCGGTTAAAGGCTTC-3′，下游引物序列：5′-GTTTCAAGACGGGCCACAAAC-3′，反应体系与反应条件参考试验方法1.4。

1.6 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂中肠免疫发育相关基因表达的影响测定

取1.3 中收集的意大利蜜蜂中肠样本，提取RNA，反转录成cDNA，qRT-PCR 检测球囊菌侵染对意大利蜜蜂中肠免疫发育相关基因表达的影响，引物序列如表1 所示，反应体系与反应条件参考试验方法1.4。

表1 意大利蜜蜂成年工蜂中肠免疫与发育相关基因引物Tab.1 Gene primers related to midgut immune and development in adult workers of Apis mellifera ligustica

1.7 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂肠道菌群含量的影响测定

取1.3 中收集的意大利蜜蜂后肠样本，提取RNA，反转录成cDNA，qRT-PCR 检测球囊菌侵染对意大利蜜蜂肠道菌群含量的影响，引物序列如表2所示，反应体系与反应条件参考试验方法1.4。

表2 意大利蜜蜂成年工蜂肠道菌群相关基因引物Tab.2 Gene primers related to intestinal flora in adult workers of Apis mellifera ligustica

1.8 数据分析

利用SPSS 21.0 软件的Kaplan-Meier 生存函数对球囊菌侵染意大利蜜蜂成年工蜂的生存数据进行统计分析，绘制意大利蜜蜂成年工蜂的生存曲线图。以Actin为内参基因，利用Ct 值法计算目的基因的相对表达量（2-△△Ct），并通过T检验进行基因差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂存活率的影响

对意大利蜜蜂成年工蜂的生存数据进行统计分析，结果表明，连续3 d 接种球囊菌孢子对意大利蜜蜂成年工蜂存活率无显著影响（χ2=0.133，P=0.715）。但从生存曲线可以看出，笼养后18～30 d，接种球囊菌组意大利蜜蜂成年工蜂的生存率与对照组相比有下降趋势（图2）。

图2 球囊菌侵染后意大利蜜蜂成年工蜂存活率Fig.2 Survival rate of worker bees in Apis mellifera ligustica after infection by Ascosphaera apis

2.2 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂中肠与后肠球囊菌含量的影响

通过qRT-PCR 测定球囊菌侵染后意大利蜜蜂成年工蜂中肠与后肠球囊菌含量，结果如图3所示。接种球囊菌孢子4 d 后，意大利蜜蜂成年工蜂后肠球囊菌孢子含量显著高于中肠球囊菌孢子含量（P＜0.05）；接种球囊菌孢子8 d后，意大利蜜蜂工蜂后肠球囊菌孢子含量显著高于中肠球囊菌孢子含量（P＜0.01）；接种球囊菌孢子4 d后，意大利蜜蜂工蜂中肠与后肠球囊菌孢子含量分别显著高于接种球囊菌孢子8 d 意大利蜜蜂工蜂中肠与后肠（P＜0.05）。对照组意大利蜜蜂中肠与后肠均未检测到球囊菌存在。

图3 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂肠道球囊菌含量的影响Fig.3 Effect of Ascosphaera apis infection on intestinal Ascosphaera apis content in adult workers of Apis mellifera ligustica

2.3 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂免疫发育相关基因表达的影响

如图4 所示，接种球囊菌孢子4 d 后，与对照组相比，处理组意大利蜜蜂成年工蜂免疫相关基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1和IMD均显著上调表达（P＜0.05），PGRP-S1、PGRP-S2、PGRP-S3、PGRP-LC、GNBP-2、PPOact、relish表达量无显著差异（P＞0.05），catus表达有下调趋势但并不显著（P＞0.05）；发育相关基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869相对表达量无显著差异（P＞0.05）。接种球囊菌孢子8 d 后，与对照组相比，处理组意大利蜜蜂成年工蜂免疫相关基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1、IMD、PGRP-S1、PGRP-S2、PGRP-S3、PGRP-LC、GNBP-2、PPOact和relish的相对表达量均无显著差异（P＞0.05）；发育相关基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869相对表达量无显著差异（P＞0.05）。

图4 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂免疫与发育相关基因表达的影响Fig.4 Effect of Ascosphaera apis infection on the expression of immune and development genes in the workers of Apis mellifera ligustica

2.4 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂肠道菌群的影响

如图5 所示，意大利蜜蜂成年工蜂接种球囊菌孢子4 d后，与对照组相比，肠道菌Snodgrassella alvi与Bifidobacteriumspp的含量有下降趋势，Gilliamella apicola、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5 与肠道总菌量U16S rRNA 的含量有上升趋势，其中LactobacillusFirm-4 与U16S rRNA 的含量显著上升（P＜0.05）；意大利蜜蜂成年工蜂接种球囊菌孢子8 d后，与对照组相比，Snodgrassella alvi与肠道菌总量U16S rRNA 的含量有下降趋势，其中U16S rRNA 的含量显著下降（P＜0.05），Gilliamella apicola、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5 与Bifidobacteriumspp 的含量有上升趋势，其中LactobacillusFirm-5的含量显著上升（P＜0.05）。

图5 球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂肠道菌群的影响Fig.5 Effect of Ascosphaera apis infection on intestinal flora in the workers of Apis mellifera ligustica

3 结论与讨论

本研究中将4×106个/mL 的球囊菌孢子连续3 d接种6 日龄意大利蜜蜂成年工蜂，对意大利蜜蜂成年工蜂的存活率无显著影响，对意大利蜜蜂成年工蜂无明显致病性，与前人研究具有相似结果[28]。球囊菌对成年蜜蜂无明显致病性，不会导致成年蜜蜂患白垩病，也不会显著影响成年蜜蜂的存活率，成年蜜蜂只是球囊菌在蜂群传播的载体，球囊菌通过成年蜜蜂给小幼虫饲喂食物侵染幼虫，导致幼虫患白垩病，球囊菌经口进入意大利蜜蜂肠道，球囊菌在蜜蜂幼虫肠道内萌发生长，首先破坏蜜蜂肠道，影响蜜蜂的个体免疫系统，其次蜜蜂中肠是蜜蜂个体免疫、分泌抗菌肽的重要器官，蜜蜂肠道核心菌群主要存在于成年蜜蜂的后肠中。因此，本研究选用意大利蜜蜂成年工蜂的中肠进行免疫、发育相关基因的表达测定，选用意大利蜜蜂成年工蜂的后肠做肠道菌群丰度检测。

将球囊菌接种意大利蜜蜂成年工蜂后，qRTPCR 检测结果表明，接种4 d 后，蜜蜂后肠球囊菌含量显著高于中肠球囊菌含量；接种8 d 后，蜜蜂中肠球囊菌含量接近于0，蜜蜂后肠球囊菌含量显著高于中肠球囊菌含量；接种4 d 后的蜜蜂后肠球囊菌含量显著高于接种8 d 的后肠球囊菌含量。以上研究结果表明，球囊菌进入意大利蜜蜂成年工蜂肠道后，并不能破坏蜜蜂中肠，不能在中肠内生长繁殖，被迅速排到蜜蜂后肠中，经过时间的推移，蜜蜂后肠的球囊菌含量也会降低，蜜蜂可能通过排泄方式排出一部分球囊菌孢子，且球囊菌孢子不能在蜜蜂后肠快速生长繁殖，球囊菌在蜜蜂肠道中何时无明显检测信号，仍需后续研究证实。球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫后，球囊菌孢子会迅速在幼虫中肠内萌发生长，在幼虫化蛹时，菌丝从后肠穿透幼虫体壁，导致幼虫死亡。而球囊菌不能在意大利蜜蜂成年工蜂肠道内迅速生长繁殖可能是肠道内环境不同及蛹变过程导致的，球囊菌孢子的萌发需要厌氧环境，菌丝的生长又需要有氧环境[29-30]，而意大利蜜蜂幼虫的肠道满足球囊菌孢子萌发生长的环境，但是意大利蜜蜂成年工蜂的肠道与幼虫期不同，导致球囊菌孢子不能萌发生长；幼虫在化蛹时期，体内营养物质丰富，脂肪体细胞降解为更易吸收小颗粒物质，转化期的幼虫免疫系统、肠道、体壁等的防御系统大大降低[12]，导致这个时期的幼虫对球囊菌防御力大大降低，而意大利蜜蜂成年工蜂没有这个时期，更减弱了球囊菌对成年蜜蜂的危害。

球囊菌侵染意大利蜜蜂成年工蜂前期会引起成年工蜂的免疫应答，导致IMD 通路上调，蜜蜂中肠免疫相关基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1等均显著上调表达；侵染后期意大利蜜蜂成年工蜂中肠内球囊菌含量接近于0，蜜蜂中肠免疫相关基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1等与未侵染组无显著差异，机体恢复到正常水平；球囊菌侵染前期与后期，意大利蜜蜂成年工蜂发育相关基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869与未侵染组相比无显著差异，球囊菌侵染不会影响意大利蜜蜂成年工蜂的发育。蜜蜂抗菌肽是蜜蜂机体抵御致病因子重要的免疫效应分子，对病原微生物具有广谱的活性，能有效抑制细菌、真菌等病原微生物的生长繁殖[31-33]，抗菌肽分子还可以与没有特异性受体的细胞膜结合，使病原微生物不容易产生抗药性[34]，农药[35]、细菌[36]、真菌[37]、病毒[38]等胁迫蜜蜂个体后，均会使抗菌肽基因高表达，免疫通路IMD 等上调表达，抗菌肽分子大量产生以应对病原微生物的胁迫。

意大利蜜蜂幼虫肠道内尚未形成肠道菌群，直到意大利蜜蜂成年工蜂6日龄才能形成完整的肠道菌群[27,39]。本研究将球囊菌孢子接种6 日龄意大利蜜蜂成年工蜂，接种4 d 后，蜜蜂肠道菌Snodgrassella alvi与Bifidobacteriumspp 的含量有下降趋势，Gilliamella apicola、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5 与肠道菌总量U16S rRNA 的含量有上升趋势；接种8 d 后，与对照组相比，Snodgrassella alvi与肠道菌总量U16S rRNA 的含量有下降趋势，Gilliamella apicola、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5 与Bifidobacteriumspp 的含量有上升趋势。前人研究表明，以色列蜜蜂麻痹病毒（IAPV）侵染意大利蜜蜂成年工蜂后会影响肠道菌Snodgrassella alvi的含量，IAPV 病毒与肠道菌Snodgrassella alvi含量呈显著负相关[40]；蜂螨侵染15日龄意大利蜜蜂工蜂后，蜜蜂肠道中的Lactobacillus菌群含量明显升高[41]；蜜蜂微孢子虫侵染也会导致蜜蜂肠道内的Bifidobacteriumspp 菌群含量显著降低[42]。以上研究结果均表明，真菌、病毒、寄生虫等外源性致病因子会影响蜜蜂肠道菌群含量，外源性致病因子侵染蜜蜂后，可能与寄主肠道菌群竞争能量和营养物质，影响肠道菌群的稳定，另外蜜蜂肠道菌群可以与蜜蜂的免疫系统协同作用抵御致病因子的入侵，在LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5、Snodgrassella alvi与Gilliamella apicola菌群的免疫应激下，蜜蜂机体会产生免疫反应产物抗菌肽abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin[43-44]，蜜蜂肠道内的Bifidobacteriumspp 菌群的活性与病原因子活性呈显著负相关，Bifidobacteriumspp 菌群可能也参与蜜蜂个体的免疫调节[45]。

综上，球囊菌孢子接种意大利蜜蜂成年工蜂后，对意大利蜜蜂成年工蜂的存活率无显著影响；球囊菌孢子在成年工蜂中肠内不能快速萌发生长，会经过蜜蜂后肠排出体外；球囊菌侵染前期会导致意大利蜜蜂成年工蜂免疫基因上调，抗菌肽基因高表达，侵染后期对意大利蜜蜂成年工蜂无显著影响，对发育相关基因无显著影响；球囊菌侵染会影响意大利蜜蜂成年工蜂肠道菌群的稳定及肠道核心菌群的含量。