基于中西医临床特点的感染后肠易激综合征动物模型分析

谢璐安，张扬雨，陈小霞，潘震东，杨贻铃，黄适，2（.广西中医药大学，广西 南宁 53000；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 53000）

肠易激综合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是多因素共同作用引起的脑-肠互动异常，症状以腹痛、腹胀或腹部不适，伴排便习惯改变或粪便性状改变，实验室检查及影像学检查常未发现器质性疾病用以解释上述症状的发生[1]。感染后肠易激综合征（Postinfectious irritable bowel syndrome，PI-IBS）是其中的一个特殊亚型：先前未诊断肠易激综合征或者无肠易激综合征症状的个体，在急性肠道感染恢复后出现了肠易激综合征症状[2]。肠易激综合征在全球普通人中的流行率为4.1%[3]，据一项荟萃分析[4]报道急性肠道感染后的个体罹患肠易激综合征的风险较无感染史的个体高4倍，其中超过10%的肠道感染患者后来发展为肠易激综合征，急性肠道感染后肠易激综合征的总患病率为11.5%。尽管其并非致命性疾病，但肠易激综合征的疾病负担可与重大疾病负担相当[5]，患者生活质量下降、心理疾病患病率升高、经济负担加重均严重影响着罹患肠易激综合征的人群。

感染后肠易激综合征的病因目前尚未明确，其机制可能与肠屏障受损及肠道低度炎症有关，目前治疗上以止泻、抗痉挛、抗焦虑、调节肠道菌群等对症治疗为主。建立有效的感染后肠易激综合征动物模型对其发病机制、病因病机的研究及防治有着重要的作用，故本研究基于感染后肠易激综合征的中西医临床诊断标准及症状特点，将现有感染后肠易激综合征动物模型的品系、造模方法、造模机制进行归纳总结，并进行吻合度评价、分析模型制备的优缺点，以期为建立符合中西医临床特点的感染后肠易激综合征动物模型提供参考。

1 感染后肠易激综合征的发病机制

1.1 西医发病机制目前感染后肠易激综合征的发病机制尚未完全阐明。据多项荟萃分析认为导致感染后肠易激综合征发病的主要危险因素一方面是早期肠道感染致发热的持续时间：发热时间越长，感染后出现感染后肠易激综合征的概率越高，这可能与感染源的毒力有关[6]；另一方面是病原体的类型及感染的严重程度：寄生虫感染后出现感染后肠易激综合征的概率较其他感染源更高，感染源的毒力因子越强，宿主免疫力越差，感染后恢复时间则越长，罹患感染后肠易激综合征的概率越高。Sethi 等[7]研究发现艰难梭菌感染患者在感染后6个月出现肠易激综合征或FGID 症状的比率是22%；而Young 等[8]对感染志贺菌人群的一项10 年随访研究发现，感染后1 年感染后肠易激综合征的发病率在13.1%，在感染后3 年人群罹患肠易激综合征的风险显著增加；对感染贾第鞭毛虫人群进行的随访研究[9]发现，感染发生后3年肠易激综合征的患病率为47%，感染后10年肠易激综合征的患病率仅稍降为43%；既往的比较研究普遍认为与细菌和寄生虫感染相比，病毒感染导致肠易激综合征的发病率相对低，但据Marshall 等[10]对食源性诺如病毒感染后人群进行的统计发现，3 个月后出现肠易激综合征症状的人群比率为23.6%，其发病率较其他感染源相比并无明显降低。在新冠后疫情时代我们还需要关注的是新冠后感染后肠易激综合征的发病情况，对新冠病毒感染人群的调查[11]发现感染过程中出现胃肠道症状的比率为3.8%，感染后肠易激综合征的发病率为3%，病毒感染致感染后肠易激综合征仍应引起我们的注意。其他危险因素还包括年龄、性别、心理因素、遗传易感倾向等。综合复杂的致病因素，其发病机制可能与肠道感染导致的肠屏障功能受损、肠上皮通透性增加以及肠道菌群紊乱有关，病理生理学上以持续的肠道低度炎症状态为特征，表现为淋巴细胞及肥大细胞浸润、免疫细胞漂移、炎症因子释放及肠嗜铬细胞增殖等，在整个病理生理过程中脑肠轴互动异常、肠道痛觉超敏及肠道运动功能紊乱等因素均可能共同作用于感染后肠易激综合征的发生发展。

1.2 中医病因病机中医并无肠易激综合征的诊断，通常根据其症状特点将其归类为“泄泻”“便秘”“腹痛”等范畴[12]。腹泻型肠易激综合征（irritable bowel syndrome with predominant diarrhea，IBS-D）为肠易激综合征常见分型中的一类，表现为以糊状便或水样便为主的粪便性质异常，并伴与排便异常相关的腹胀、腹痛或腹部不适。古籍中对IBS-D也有类似的记载，如《难经》[13]：“大肠泄者，食已窘迫，大便色白，肠鸣切痛”，又如《灵枢》[14]所述：“大肠病者，肠中切痛而鸣濯濯。冬日重感于寒即泄，当脐而痛不能久立”。感染后肠易激综合征多表现为腹痛、腹泻等症状，与IBS-D症状相接近，结合其前期存在感染史，中医病名上更契合于“痛泻”“大肠泻”“肠郁”等。据《医方考》：“泻责之脾，痛责之肝，肝责之实，脾责之虚，脾虚肝实故令痛泻”。肠易激综合征的病位主要在于肝脾，病因主要是脾胃虚弱、情志不畅，复感外邪，最终形成了肝脾不和、正虚邪恋的病机特点。感染后肠易激综合征是急性胃肠道感染后出现反复腹痛、腹泻等症状的疾病，其致病关键在于脾气虚弱、湿邪留恋，复加情志因素影响，故诸症迁延难愈。常因感受外邪后经治疗或自愈后外邪未尽，正气已损而未复，致病邪气主要为湿邪，湿性重浊、粘滞、易袭阴位，故见反复发作、绵延不断的泄泻症状；湿伤阳气，脾阳受湿邪碍腻，致本已受损的脾阳更为不振，无力运化水谷，发为泄泻、纳食不馨等症。脾胃为气机升降之枢纽，本已受湿邪影响气机运转受阻，外加情志因素，肝气横逆犯脾，枢机窒塞，气机郁滞，脾胃更为虚弱，则生诸疾。正如《黄帝内经》所云：“正气存内，邪不可干”“邪之所凑，气其必虚”。因此，可根据疾病各发展阶段的病机特点将感染后肠易激综合征的证型归纳为：肝郁脾虚证、肝气郁滞证、脾胃虚弱证和寒热错杂证[15]。

2 感染后肠易激综合征的诊断标准及中医辨证标准

2.1 西医诊断标准及临床表现目前国内外指南内尚无明确感染后肠易激综合征诊断标准，故西医诊断标准、临床表现参照《Bowel disorders》[18]中提及的罗马Ⅳ标准、罗马基金会工作组对感染后肠易激综合征的工作报告[16]及Spiller 等[2]、Ghoshal[17]对感染后肠易激综合征的定义及症状描述，详见表1。

表1 感染后肠易激综合征（PI-IBS）的西医诊断标准Table 1 Diagnostic criteria of western medicine for post-infection irritable bowel syndrome（PI-IBS）

根据感染后肠易激综合征的西医诊断标准并引入田硕[19]的动物模型判定方法：感染后肠易激综合征与肠易激综合征的鉴别点在于是否发生于急性肠道感染后，故具备肠道感染的病史是感染后肠易激综合征的特点，因此通过外部感染源感染诱导肠道炎症状态，对于感染后肠易激综合征动物模型的建立而言至关重要，属于I 类指标（核心指标），符合这一条件的模型赋值30%。如造模后病原学检测阳性率达九成或病理学提示处于炎症后阶段则提示下一阶段的感染后模型建立明确，属于I 类指标（核心指标），符合这一条件赋值30%。实验动物与人类存在生理及行为上的差异，在动物上完美复制出人类疾病形态是近乎不可能的，因此在对动物模型进行临床吻合度评估时，更多的是依据症状间接表现指标及动物行为学变化进行评价。常用的评估内脏敏感性的动物间接指标有腹壁回撤反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）评分、结肠肌电活动变化等；评估肠道活动速度的间接指标有肠道标志物运转力、大便频率统计等；评估粪便性状的间接指标有Bristol 分级、粪便含水量测定、腹泻指数等；内脏高敏感性、肠道活动加快、粪便性状稀烂为感染后肠易激综合征主要临床症状（腹痛腹胀或腹部不适、大便次数增多、腹泻）的间接表现指标，为Ⅱ类指标（直接相关指标），每满足1 项赋值10%。其他表现指标划分为Ⅲ类指标（间接相关指标），每满足1 项赋值3.3%。总值为100%，各症状对应表现及赋值标准详见表2。

表2 感染后肠易激综合征（PI-IBS）西医临床特点与动物模型表现对应表及赋值标准Table 2 Assignment criteria and the correspondence table between clinical features of PI-IBS in western medicine and situation of animal models

2.2 中医辨证标准感染后肠易激综合征的中医辨证标准参照《中药新药用于肠易激综合征临床研究技术指导原则》（2017）、《中医病证诊断疗效标准》[20]及《肠易激综合征中医诊疗专家共识意见》（2017）[21]中的辨证分型标准，将其分为肝郁脾虚证、脾虚湿盛证、脾肾阳虚证、寒热错杂证4种证型，详见表3。

表3 感染后肠易激综合征（PI-IBS）的中医辨证分型Table 3 Traditional Chinese medicine syndrome differentiation of PI-IBS

基于感染后肠易激综合征中医诊断标准及《中医临床诊疗指南释义（脾胃分册）》[22]将各证型症状划分为主症和次症，并引入田硕[19]的动物模型判定方法：腹痛、泄泻、排便次数增加、神志变化为各证型共有症状，属于主症，每符合一个条件赋值20%。纳食变化、外观变化及体质量变化为各证型不同症状，属次症，如肝郁脾虚证动物模型会出现外界刺激或造模应激时易激惹抵抗、出现攻击性表现，无刺激条件下则自主活动减少、扎堆聚集于角落，进食量减少，耳廓颜色淡红，皮毛干枯毛躁；脾虚湿盛证动物模型会出现对外界刺激反应不敏感，对造模应激抵抗程度轻，蜷缩聚集于角落，进食量减少，耳廓颜色淡白，皮毛晦暗；脾肾阳虚证动物模型会出现对外界刺激反应少，对造模应激抵抗程度轻，蜷缩甚至堆叠于角落，进食量少，耳廓颜色晦暗，皮毛晦暗干枯；寒热错杂证动物模型会出现对外界刺激易激惹，对造模应激抵抗程度强，蜷缩甚至堆叠于角落，进食水少，耳廓颜色晦暗，皮毛晦暗干枯。符合次症中每一分项，赋值6.6%。总值100%，各症状对应表现及赋值标准详见表4。

表4 感染后肠易激综合征（PI-IBS）中医临床特点与动物模型表现对应表及赋值标准Table 4 Assignment criteria and the correspondence table between clinical features of PI-IBS in Chinese medicine and situation of in animal models

3 感染后肠易激综合征常见动物模型

3.1 模型动物的选择感染后肠易激综合征动物模型常以实验大鼠、小鼠居多。大鼠有SD、Wistar 大鼠；小鼠有C57BL/6、NIH 小鼠、CD-1 小鼠。其中以成年SD 大鼠及C57BL/6 小鼠最为多见，考虑与啮齿类实验动物品系稳定、性情温顺，外源感染普遍易感更易于造模、肿瘤自发生率低有关。

3.2 动物模型与临床吻合度感染后肠易激综合征的造模方法主要分为外源感染诱导和化学物质诱导两大类。外源感染诱导可细分为：细菌感染诱导，方法分别有空肠弯曲杆菌感染、鼠伤寒沙门氏菌感染、鼠类柠檬酸杆菌感染、福氏志贺痢疾杆菌感染；寄生虫感染诱导，方法分别有旋毛虫感染、贾第鞭毛虫感染、隐孢子虫感染、巴西日圆线虫感染；病毒感染诱导，方法有单纯疱疹病毒感染。化学物质诱导肠道损伤炎症后造模的方法分别有三硝基苯磺酸（TNBS）诱导、葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导、脱氧胆酸（DCA）诱导、乙酸诱导、异硫氰酸烯丙酯（OM）诱导、酵母聚糖诱导等方法。现对以上动物模型进行造模方法及机制总结，并分析评价其临床特点吻合度及制备优缺点，详见表5。各模型中西医临床吻合度可视化展示详见图1。

图1 感染后肠易激综合征（PI-IBS）动物模型中西医临床吻合度Figure 1 Consistency between animal model of PI-IBS and clinical symptoms of Chinese and western medicine

表5 感染性肠易激综合征（PI-IBS）动物模型与中西医临床病证吻合情况Table 5 Consistency between animal model of PI-IBS and clinical symptoms of Chinese and western medicine

4 讨论

构建感染后肠易激综合征（PI-IBS）动物模型是研究感染后肠易激综合征发病机制以及筛选有效防治药物的重要手段。理想的感染后肠易激综合征动物模型应同时具备早期急性肠道感染状态及后期感染恢复后肠道存在慢性炎症状态。目前常用的模型动物多为啮齿类动物，大鼠、小鼠因其繁殖快且品系稳定、饲养难度低而广泛应用于各类造模方法中，仓鼠则多用于病毒感染类的模型[59]，除啮齿类动物外亦有应用斑马鱼建立炎症后肠易激综合征模型[60]的造模形式。感染后肠易激综合征动物模型类型较多，模型特点和造模原理各有不同，模型的应用范围及吻合的临床症状也因此有所不同。

4.1 目前感染后肠易激综合征动物模型的分类及优缺点当前感染后肠易激综合征动物模型的制备方法主要集中为外源感染诱导及化学物质诱导两大类，常通过结合不同的病因模拟手段及不同角度的观察手段来展现模型的中西医临床吻合情况。

外源感染诱导的感染后肠易激综合征模型通过使模型动物获得肠道感染来模拟人类肠道急性感染过程，这与感染后肠易激综合征病例发生于细菌、寄生虫或病毒感染后的发病过程相符合，且对疾病直接相关指标表现力较好。但在模型制备过程中，感染源的获取及制备过程相对繁杂，且可能因需针对不同品系的动物调整感染攻击剂量，导致造模周期延长。对于外源感染诱导的感染后肠易激综合征模型而言，造模的成模率多取决于外源感染源的株型及感染量、模型动物的品系、造模途径：①感染源的株型及感染量：不同株型对同一宿主的定植率存在差异，有研究[61]比较发现宿主适应后的空肠弯曲杆菌分离株定植率更高。不同感染剂量下的模型动物表现各不相同，剂量过低导致感染恢复过快、症状表现欠佳，剂量过高则易导致模型动物死亡，如在模型制备过程中如首次感染接种超1 000 个巴西日圆线虫幼虫会导致模型小鼠免疫抑制甚至死亡[62]。一个理想的感染后肠易激综合征模型需要找到一个合适的感染剂量，如传统的空肠弯曲杆菌感染模型存在内脏高敏表现欠佳、成模率低的缺点，曹亚男等[23]通过改良传统方法将感染剂量由108CFU·mL-1提高到1010CFU·mL-1后，感染成功率明显提高。②造模动物的品系：不同品系的动物对不同种类的感染源反应各有不同，造模需根据不同品系动物的易感特点进行模型动物选择。如旋毛虫感染后的变化在NIH/Swiss 小鼠是特有的，在Balb/c 小鼠中则无法体现。除影响成模率外，尚有可能造成模型动物死亡，如Crepin 等[63]发现不同品系小鼠对鼠类柠檬酸杆菌感染反应不同，C57BL/6 小鼠感染后表现为解软便及内脏高敏，而C3H/Hej小鼠则易患致命的感染后腹泻，导致死亡率升高。③造模途径：外源感染的造模途径常见的有灌胃、腹腔注射、皮下注射等，针对不同种类的感染源各造模方法各有利弊。如吕军苹[64]通过比较腹腔注射及灌胃感染鼠伤寒沙门氏菌两种途径发现，腹腔注射的造模方式过于灵敏，急性发病率高，虽然可出现典型的腹泻症状及体质量、毛发、精神状态变化，但对注射浓度要求精确，且造模死亡率高，并不利于后续实验及组织样本采集。Camberis 等[62]则提出对于制备巴西日圆线虫感染模型，皮下注射途径比灌胃及腹腔注射途径更能保证虫体活性及有效感染率。结合感染后肠易激综合征的发病过程，外源感染多通过粪口途径进行传播，利用灌胃途径建立细菌、寄生虫或病毒感染诱导的感染后肠易激综合征模型，更符合疾病形成过程。与此同时，近期有研究[65]发现新冠病毒感染后部分人群出现肠易激综合征症状，在新冠疫情后时代基于人群需求，此处需要讨论的是通过非肠道途径使动物获得外源感染后表现出感染后肠易激综合征典型症状的模型是否符合感染后肠易激综合征的建模要求，如Sencio[59]等通过滴鼻途径使小鼠感染流感病毒后出现了明显的肠屏障受损表现，是感染后全身免疫应激并在实验过程中把关注重点放在了肠屏障上，还是感染源通过非肠道途径感染后仅攻击消化道，仍需更多的实验设计验证及探索。

化学物质诱导模型则通过模拟感染源对肠道黏膜造成的损伤及由此引起的持续肠道炎症状态来模拟感染后肠易激综合征的发病过程。应用TNBS、DCA、乙酸等对模型动物进行灌肠都是常用的肠易激综合征、炎症性肠病的造模方法，模型可复制性高、造模成功率有保障。但化学物质诱导造模存在两个弊端，其一是缺乏感染后肠易激综合征发病过程中的急性感染过程：众所周知，肠道感染是一个复杂的病理生理过程，单一化学物质诱导的模型通常无法同时体现感染后肠易激综合征的多个疾病特征，这可能与单一物质无法完全模拟外源感染造成的复杂损伤有关，更适合用于研究感染后肠易激综合征发病机制中的某一方面，这也提示了复合造模方法的重要性。其二是造模的用药剂量、溶剂、灌肠深度及评估造模效果的时间点尚无统一标准：TNBS、DCA 等化学物质广泛用于肠易激综合征、溃疡性结肠炎及克罗恩病等模型的诱导物质，各病的发病机制及病理表现均不同，则在造模过程中需通过干预化学物质给药剂量来控制动物的病理表现以达到造模目的。Qin等[43]比较了低、中、高剂量TNBS、不同浓度乙醇溶剂及不同灌肠深度对SD 大鼠造模的影响，发现每只大鼠予低剂量TNBS（5 mg·0.8 mL-1），溶剂采用50%乙醇，距肛门8 cm 处结肠给药可成功造模符合感染后肠易激综合征黏膜损伤、肠道低度炎症及内脏痛觉过敏症状的模型。可见，完善不同浓度化学物质及其溶剂的造模剂量，比较不同给药深度的造模方法是建立感染后肠易激综合征动物模型的关键。

4.2 优势感染后肠易激综合征动物模型的优缺点综合中西医临床吻合度及造模优缺点，较为贴切的感染后肠易激综合征模型是空肠弯曲杆菌感染模型、旋毛虫感染模型以及病症结合模型中的肝郁脾虚证模型。

空肠弯曲杆菌是全球范围内食源性细菌性胃肠炎的常见病因，可利用其致人畜共患病的特点对大鼠进行造模，该模型具有操作相对简易，内脏高敏及肠道运动障碍表现明显的特点，缺点是对感染剂量要求较高且需筛选出敏感感染株；旋毛虫感染模型是经典的感染后肠易激综合征建模方法，可感染包括人类在内的哺乳动物引起旋毛虫病，感染累及十二指肠、回肠，可引起持续时间较长的内脏高敏感、肠道低度炎症及肠道运动障碍，缺点是旋毛虫有一定概率穿破肠道进入腹腔引起全身炎症反应从而覆盖肠道炎症表现，且旋毛虫制备过程复杂，总实验周期长；病证结合中的肝郁脾虚证模型是通过慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节+旋毛虫感染的复合方法造模，从病因角度采用应激、疲劳等方法构建证型模型，以方测证，优点是建模后可观察到较为完整的直接及间接临床指标表现，缺点是造模方法相对复杂、实验周期长。

4.3 总结与展望总结优势模型发现，具备合适且攻击剂量有效的外界感染源是制备临床指标表现力好的感染后肠易激综合征动物模型的关键，在此基础上增加对疾病模型不同症状角度的观察、测量及结合其他致病因素协同造模，基于此制备的感染后肠易激综合征动物模型中西医临床吻合度将大大提高。但是结合总结结果看，当前符合现代中医药科研需求的病证结合的感染后肠易激综合征模型相对较少，究其原由是因为缺乏规范客观的动物中医症状评价标准、缺乏规范的动物模型辨证方法，导致针对中医临床症状多维度的观察开展受限。病证结合模型的优势是可将动物特质、疾病特点与中医证候特点相融合，在实验过程中能充分体现辨证论治的中医思想[66]。为更好地建立病症结合感染后肠易激综合征动物模型，为中医药防治感染后肠易激综合征提供动物实验支持，本研究综合现有病证结合动物模型的建立方法，可从以下对感染后肠易激综合征建模方法进行改进：①病证结合模型需找到各证型的客观评价指标：可采用代谢组学、蛋白质组学等组学技术系统性地对不同证型患者的代谢物等进行分析建立数据模型，在大量样本中找到同一证型的共同标志物，以此形成微观、可量化的客观评价指标对模型进行评价。②丰富动物四诊的信息采集：可通过量化动物行为积分，形成证型积分公式，尚可纳入进食水量、基础生命征等作为辅助小权重指标；可采用红外热成像仪、动物内镜、核磁共振等仪器对实验动物进行检查，收集具象的图像信息，对图像进行分类分级积分，纳入证型积分公式。目前针对动物模型的证候体系尚未确立，病证结合动物模型建模成功的标准当以动物标准客观参数与人类疾病原型、临床证候诊断标准基本相贴合甚至相同[67]。但建模过程中仍需认识到人类与实验动物存在诸多区别，模型仍有其自身的局限性，不可能完全复制目标疾病，对于模型的评价与使用仍需具体实验具体调整。

综上所述，目前较为理想的感染后肠易激综合征动物模型是空肠弯曲杆菌感染模型、旋毛虫感染模型。此外，吻合度略次的病症结合模型也具有较大的应用价值，采用复合方式造模可建立中西医病证体系更完善的感染后肠易激综合征模型，既符合感染后肠易激综合征的发病过程及病理特点，又贴切中医证候特点，依从中医基本的辨证论治原则，加强病与证的关系，可为研究感染后肠易激综合征发病机制及探讨其证候间分子差异提供理论支持，也可为研究中药单药或复方防治感染后肠易激综合征提供动物实验支持。因此，在现有的造模方式的基础上继续完善，建立更加完善的贴切于中西医临床病证特点的感染后肠易激综合征动物模型将是防治各类感染后肠易激综合征及炎症性肠病的研究热点，具有广阔的研究前景。