HPLC 法测定参蒲益智缓释胶囊中人参皂苷Rg1、Re、Rd 含量*

谢海龙，孟怡彤，董晏含，常英杰，朱艳华

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，黑龙江 虎林 158400）

人参中含有多种化学成分，包括皂苷类、多糖类、黄酮类等成分，其中主要活性成分且研究最多的是人参皂苷类成分[1]。人参具有安精神，定魂魄，止惊悸，开心益智[2]之功效，现代研究表明，人参皂苷类成分对中枢神经、心脑血管和免疫系统均有显著的保护作用[3-5]。本实验室选用人参配伍石菖蒲制备了参蒲益智缓释胶囊，用于改善认知能力，尤其对血管性认知障碍（VCI）[6]的预防及治疗效果尤佳。

本文应用高效液相色谱（HPLC）对参蒲益智缓释胶囊中人参皂苷Rg1、Re、Rd 的含量进行测定，为参蒲益智缓释胶囊的质量控制研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与药品

人参皂苷Rg1标准品（B21057 源叶生物）；人参皂苷Re 标准品（B21055 源叶生物）；人参皂苷Rd标准品（B21054 源叶生物）；参蒲益智缓释胶囊（实验室自制）；甲醇、乙腈，色谱纯，DIKMA 公司；H3PO4（色谱纯 科密欧化学试剂有限公司）。

BT25S 型电子分析天平（德国Sartorius 公司）；KQ5200DB 型数控超声波清洗器（永泰超声仪器有限公司）；A2010 型岛津液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 3 种人参皂苷分析方法的建立

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD（C18柱，250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～30min，19% B；30~35min，19%～24% B；35~66min，24%～40% B）；检测波长203nm；流速1.0mL·min-1；柱温30℃；进样量20μL。

1.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rd 对照品2.00、3.00、5.00mg，先用适量的0.1mol·L-1HCl 溶液使其充分溶解，再用0.1mol·L-1HCl 溶液将其定容至10mL 容量瓶内，摇匀，分别配制成人参皂苷Rg1200.00μg·mL-1、人参皂苷Re 300.00μg·mL-1、人参皂苷Rd 500.00μg·mL-1的标准品储备液。分别精密吸取1mL 上述人参皂苷Rg1、Re、Rd 标准储备液，用0.1mol·L-1HCl 溶液定容至10mL 容量瓶内，摇匀，作为混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密称取5 粒缓释胶囊内容物，每粒胶囊约0.50g，混匀，取适量颗粒并精密称定1.50g（约含400mg 人参总皂苷），加入适量0.1mol·L-1HCl 溶液使其溶解，再用0.1mol·L-1HCl 溶液定容于100mL 容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.4 空白溶液的制备 按照比例称取辅料，用0.1mol·L-1HCl 溶液溶解后，定容至10mL 容量瓶内，摇匀，作为空白溶液。

2 结果与讨论

2.1 专属性考察

使用0.22μm 滤膜过滤空白溶液、对照品溶液和供试品溶液。按照“1.2.1”的色谱条件进行分析，结果见图1。

图1 人参总皂苷高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of total ginsenosides

由图1 可见，人参皂苷Rg1、Re、Rd 的保留时间分别约为36.6、37.1、63.3 min，且对照品、供试品的峰形较好，辅料峰未产生干扰，证明此方法的专属性好。

2.2 线性关系考察

取“1.2.2”项下对照品储备液，分别精密吸取人参皂苷Rg1、Re、Rd 对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 置于10mL 容量瓶中，分别得到2.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00μg·mL-1的人参皂苷Rg1对 照 品 溶 液，3.00、6.00、12.00、18.00、24.00、30.00μg·mL-1的人参皂苷Re 对照品溶液和5.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00μg·mL-1的人参皂苷Rd 对照品溶液，用0.22μm 滤膜过滤，取续滤液按照“1.2.1”的色谱方法进样分析，记录峰面积。分别以人参皂苷Rg1、Re、Rd 浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别得到人参皂苷Rg1标准曲线方程为Y=487777X-261994（R2=0.9998）、人参皂苷Re 标准曲线方程为Y=274628X-146458（R2=0.9995）、人参皂苷Rd 标准曲线方程为Y=248940X-66784（R2=0.9995）。标准曲线分别见图2、3、4。

图2 HPLC 法测定人参皂苷Rg1 标准曲线Fig.2 Standard curve for the determination of ginsenoside Rg1 by HPLC

由图2～4 可知，人参皂苷Rg1、Re、Rd 分别在2.00~20.00、3.00~30.00、5.00~50.00 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.3 精密度考察

2.3.1 日内精密度 分别配制浓度为2.00、8.00、16.00μg·mL-1的人参皂苷Rg1对照品溶液，3.00、12.00、24.00μg·mL-1的人参皂苷Re 对照品溶液，5.00、20.00、40.00μg·mL-1的人参皂苷Rd 对照品溶液，平行配制6 份，按照“1.2.1”的色谱条件进样，记录峰面积，计算人参皂苷Rg1、Re 和Rd 日内精密度，结果均小于2%，符合方法学考察。

2.3.2 日间精密度 分别配制浓度为2.00、8.00、16.00μg·mL-1的人参皂苷Rg1对照品溶液，3.00、12.00、24.00μg·mL-1的人参皂苷Re 对照品溶液，5.00、20.00、40.00 μg·mL-1人参皂苷Rd 对照品溶液，平行配制6 份，按照“1.2.1”的色谱条件进样，连续3d，记录峰面积，计算人参皂苷Rg1、Re 和Rd 日间精密度，结果均小于2%，符合方法学考察。

2.4 稳定性实验

按照“1.2.3”项下的供试品溶液配制方法平行配制6 份溶液，按照“1.2.1”的色谱条件分别在0、2、4、6、8、12 和24h 进样，记录峰面积，计算人参皂苷Rg1、Re 和Rd 的RSD 值，结果分别为0.45%、0.19%、0.20%，均小于2%。结果表明，人参皂苷Rg1、Re 和Rd 在24 h 内稳定性良好。

2.5 加样回收率

取样品6 份，每份约0.75g（约含人参皂苷Rg1、Re、Rd 分别为0.5、0.25、1.0mg），精密称定，置于10mL 容量瓶中，加0.1mol·L-1HCl 溶液超声溶解并稀释至刻度，精密吸取1mL 置于5mL 容量瓶中，分别依次加入人参皂苷Rg14.00μg·mL-1、人参皂苷Re 6.00μg·mL-1和人参皂苷Rd 10.00μg·mL-1对照品溶液1mL，加0.1mol·L-1HCl 溶液超声稀释至刻度，摇匀，照“1.2.1”的色谱条件进样，记录峰面积，按式（1）计算加样回收率。

加样回收率=（人参皂苷测得量-样品中人参皂苷的含量）/人参皂苷对照品加入量×100% （1）

结果表明，平均回收率在80%~120%之间，且RSD 值小于2%，符合方法学考察要求。

2.6 含量测定

按照“1.2.3”项下方法制备3 批供试品溶液，按照“1.2.1”项下条件进样分析，通过峰面积值计算每粒缓释胶囊中3 种人参皂苷的含量，结果显示，人参皂苷Rg1含量分别为0.51、0.57、0.54mg·粒-1，其平均含量为0.54mg·粒-1；人参皂苷Re 含量分别为1.35、1.31、1.34mg·粒-1，其平均含量为1.33mg·粒-1；人参皂苷Rd 含量分别为2.15、2.17、2.11mg·粒-1，其平均含量为2.14mg·粒-1。

3 结论

本文采用HPLC 法建立了参蒲益智缓释胶囊中3 种人参皂苷含量的测定方法，并进行了相应的方法学考察。结果表明，人参皂苷Rg1、Re 和Rd 在其浓度范围内线性关系良好，方法学考察结果也均符合要求，准确度高，重现性好。本实验为参蒲益智缓释胶囊的后续研究提供了参考。