绿原酸抑制巨噬细胞激活的机制研究Δ

郑薇 ，郎静 ，黄西凤 ，肖锐 ，白荷 ，贾济 #（.中国人民解放军南部战区总医院麻醉科，广州 5050；.中国人民解放军西部战区总医院骨科，成都 60083）

巨噬细胞过度激活与多种炎症相关疾病的发生发展密切相关，包括川崎病、自身免疫性肝病、肾病和心肌疾病等[1—3]。巨噬细胞过度激活后，可释放多种促炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）和IL-6等。上述促炎性细胞因子可通过血液循环损伤体内多个脏器，继而造成脏器功能受损，甚至危及生命[4]。因此，可通过抑制巨噬细胞的过度激活，降低炎症反应水平，进而控制相关疾病的发生发展[5]。

绿原酸是富含于中药金银花中的一种苯丙素类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗过敏和利胆等药理作用[6]。目前，关于绿原酸的相关研究多聚焦在抑制炎症反应方面。有研究报道，绿原酸的抗炎机制包括抑制巨噬细胞/小胶质细胞激活和调节p38分裂原激活的蛋白激酶/Toll样受体等细胞信号通路[7]，但其详细抑炎机制尚不明确。骨髓细胞2表达的触发受体（triggering receptors expressed on myeloid cells-2，TREM2）是表达于巨噬细胞上的一种蛋白，可调控巨噬细胞激活程度，抑制炎症反应[8]。本研究使用经典致炎物质脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞，模拟巨噬细胞激活[9]，观察绿原酸对LPS所致巨噬细胞激活的影响和TREM2在其中的作用，为阐明绿原酸的抗炎机制提供实验室证据。

1 材料

1.1 主要仪器

Series 2型细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Infinite 200型酶标仪购自瑞士Tecan公司；Criterion型电泳仪和GelDoc Go型凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司；FV10i型共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 主要药品与试剂

绿原酸原料药（批号327-97-9，纯度＞95%）、DMEM细胞培养基（批号D5796）、胎牛血清（批号9014-87-7）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批号67-68-5）和MTT（批号298-93-1）均购自美国Sigma-Aldrich公司；TNF-α、IL-1β和IL-6促炎性细胞因子检测试剂盒（批号分别为20220314、20220517、20220418）均购自中国南京建成生物工程研究所；兔抗小鼠诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）（批号ab178945）、核因子κB p65（nuclear factor κB p65，NF-κB p65）（批号ab32536）一抗和山羊抗兔IgG预吸附二抗（批号ab7090）均购自英国Abcam公司；TREM2小干扰RNA（TREM2-small interfering RNA，TREM2-siRNA）（批号HU079401）、乱序-siRNA（SC-siRNA，批号SIC001）和转染液（批号L3287）均购自瑞士Qiagen公司；Cy3标记的山羊抗兔荧光二抗（批号A0516）和青链霉素混合溶液（批号C0223）均购自中国碧云天生物技术有限公司。

1.3 细胞系

实验用小鼠RAW264.7巨噬细胞系获赠于中国科学院上海生命科学研究所。RAW264.7巨噬细胞在DMEM细胞培养基中培养，培养基含10%胎牛血清、10 U/mL的青霉素和10 μg/mL的链霉素。培养箱内空气含95%O2和5%CO2，温度为37 ℃，湿度为100%。每2～3 d更换培养基1次，每周以1∶4的比例传代2次。取对数生长期细胞进行后续实验。

2 方法

2.1 LPS造模浓度的筛选

2.1.1 细胞分组及处理

为确定适宜的LPS刺激强度，将细胞分为Control组和不同质量浓度（1、10、100 ng/mL，参考预实验结果设置）LPS处理组。细胞在含有上述药物的培养基/空白培养基内孵育24 h后，进行以下各项检测。

2.1.2 细胞培养上清液中IL-6水平的检测

将细胞接种于24孔板中，密度为5×105个/孔，24 h细胞贴壁后，按“2.1.1”项下方法分组（每组8个复孔）、给药、培养细胞，然后提取各孔细胞培养上清液200 μL置于离心管内，于4 ℃下5 000 r/min离心30 min。离心结束后，吸弃上清液150 μL，根据IL-6试剂盒说明书检测IL-6水平。

2.1.3 细胞中iNOS蛋白表达水平的检测

采用Western blot法检测细胞中iNOS蛋白的表达水平。将细胞接种于6孔板中，密度为1×106个/孔，24 h细胞贴壁后，按“2.1.1”项下方法分组（每组4个复孔）、给药、培养细胞。培养结束后，吸弃上层培养基，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3次（5 min/次），然后每孔加入细胞裂解液500 μL，在4 ℃下裂解5 min，采用细胞刮将细胞收集至清洁的离心管内，在4 ℃下以12 000 r/min离心30 min后，收集上清液，采用Bradford法进行蛋白定量。取蛋白进行高温变性后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压120 V，电泳时间2 h），并转移至聚偏二氟乙烯膜上（转膜电流200 mA，转膜时间2 h），加入5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原，4 ℃孵育过夜；加入稀释的iNOS、GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶500、1∶1 000），在37 ℃下孵育4 h；洗膜后加入山羊抗兔IgG预吸附二抗（稀释比例为1∶1 000），室温孵育60 min；使用化学发光法显色后，采用凝胶成像系统成像，使用Image Lab软件分析各条带的灰度值，以iNOS蛋白与GAPDH蛋白的灰度值比值表示iNOS蛋白的表达水平。

2.2 绿原酸给药浓度的筛选

2.2.1 细胞分组及处理

参考相关文献中的绿原酸浓度[10]，将细胞分为Control组、LPS处理组（10 ng/mL，按“2.1”项下结果设置，下同）和不同浓度绿原酸干预组（培养基分别含0.01、0.1、1 μmol/L 绿原酸和10 ng/mL LPS），每组8个复孔。将细胞在含有上述药物的培养基/空白培养基中常规孵育24 h后，进行以下各项检测。

2.2.2 细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平的检测

按“2.1.2”项下方法接种细胞，常规培养，待细胞贴壁后，按“2.2.1”项下方法进行细胞分组、给药与培养，然后根据TNF-α和IL-1β试剂盒说明书检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平。

2.2.3 细胞中iNOS、TREM2蛋白表达水平的检测

采用Western blot法检测细胞中iNOS、TREM2蛋白的表达水平。按“2.1.3”项下方法接种细胞，常规培养，待细胞贴壁后，按“2.2.1”项下方法进行细胞分组（每组4个复孔）、给药、培养，按“2.1.3”项下方法进行指标检测。本实验中iNOS、GAPDH、TREM2、β-actin一抗的稀释比例分别为1∶500、1∶1 000、1∶200、1∶1 000。以iNOS蛋白与GAPDH蛋白的灰度值比值表示iNOS蛋白的表达水平，以TREM2蛋白与β-actin蛋白的灰度值比值表示TREM2蛋白的表达水平。

2.2.4 细胞活力的检测

采用MTT法检测细胞活力。将细胞接种于96孔板中，密度为1×105个/孔，待细胞贴壁后，按“2.2.1”项下方法进行细胞分组（每组8个复孔）、给药和培养。培养结束后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37 ℃孵育4 h后；吸弃上层培养基，每孔加入150 μL的DMSO，振荡15 min，待甲瓒完全溶解后，取空白孔加150 μL蒸馏水作为空白组，在490 nm波长处使用酶标仪检测各孔吸光度，计算细胞活力。细胞活力（%）＝（实验组吸光度-空白组吸光度）/（Control组吸光度-空白组吸光度）×100%。

2.3 TREM2在绿原酸抑制巨噬细胞激活中的作用考察

2.3.1 转染TREM2-siRNA对巨噬细胞中TREM2蛋白表达水平的影响

将细胞接种于6孔板中，密度为1×106个/孔。接种24 h后，吸弃上层培养基，每孔加入含90 pmol的TREM2-siRNA转染液1 mL，37 ℃孵育6 h后，吸弃上层转染液；PBS常温清洗3次，每孔加入细胞裂解液200 μL，裂解30 min后，收集细胞；按“2.2.3”项下方法检测细胞中TREM2蛋白的表达水平。实验重复4次。

2.3.2 细胞分组及处理

为观察TREM2在绿原酸抑制巨噬细胞激活中的作用，将细胞分为Control组、LPS处理组（10 ng/mL LPS）、绿原酸+LPS组[培养基含1 μmol/L绿原酸（按“2.2”项下结果设置）和10 ng/mL LPS]、TREM2-siRNA+绿原酸+LPS组（细胞经TREM2-siRNA处理后，再经1 μmol/L绿原酸和10 ng/mL LPS处理）和SC-siRNA+绿原酸+LPS组（细胞经SC-siRNA处理后，再经1 μmol/L绿原酸和10 ng/mL LPS处理），每组8个复孔。在含有上述药物的培养基/空白培养基中孵育24 h后，进行以下各项检测。

2.3.3 干扰TREM2表达后细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平的检测

按“2.1.2”项下方法接种细胞，常规培养，待细胞贴壁后，按“2.3.2”项下方法进行细胞分组、给药，根据TNF-α、IL-1β试剂盒说明书检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平。

2.3.4 干扰TREM2表达后细胞中iNOS蛋白染色情况的检测

将细胞接种于共聚焦显微镜专用培养皿中，密度为1×105个/孔。接种24 h后，按“2.3.2”项下方法分组处理，吸去上层培养基，每孔加入4%多聚甲醛溶液1 mL固定，30 min后，PBS清洗3次，5 min/次；随后，每孔加入1%牛血清白蛋白1 mL包被非特异性抗原，30 min后，PBS清洗1次；每孔加入iNOS一抗（稀释比例为1∶100），在4 ℃下孵育12 h后，PBS清洗3次，5 min/次；每孔加入Cy3标记的山羊抗兔荧光二抗（稀释比例为1∶100）200 μL，常温避光孵育90 min；随后，每孔加入100 μL的DAPI染液标记细胞核（蓝色），常温避光孵育5 min后，PBS避光清洗3次，5 min/次；采用共聚焦显微镜在532 nm波长处进行观测，并随机选取视野拍照。

2.3.5 干扰TREM2表达后细胞中TREM2、iNOS和NFκB p65蛋白表达水平的检测

按“2.1.3”项下方法接种细胞，常规培养，待细胞贴壁后，按“2.3.2”项下方法分组、处理，每组4个复孔。培养结束后，按“2.1.3”项下方法操作检测TREM2、iNOS和NF-κB p65蛋白表达水平，iNOS、GAPDH、TREM2、βactin、NF-κB p65一抗的稀释比例分别为1∶500、1∶1 000、1∶200、1∶1 000、1∶200。以iNOS蛋白与GAPDH蛋白的灰度值比值表示iNOS蛋白的表达水平，以TREM2、NFκB p65蛋白与β-actin蛋白的灰度值比值分别表示TREM2、NF-κB p65蛋白的表达水平。

2.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 20.0软件进行分析处理。所有数据均采用±s表示，组间差异采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验进行分析。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 LPS造模浓度的筛选结果

与Control组[（7.25±2.22） pg/mL]比较，10、100 ng/mL LPS处理组细胞培养上清液中IL-6水平[（121.80±8.85）、（126.30±8.65） pg/mL]均显著升高（P＜0.05）。与Control组（0.12±0.02）比较，10、100 ng/mL LPS处理组细胞中iNOS蛋白表达水平（0.84±0.06、0.86±0.04）均显著升高（P＜0.05），且10、100 ng/mL LPS处理组间细胞中iNOS蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，本研究选择质量浓度为10 ng/mL的LPS进行后续实验。iNOS蛋白表达的电泳图见图1。

图1 不同质量浓度LPS作用下巨噬细胞中iNOS蛋白表达的电泳图

3.2 绿原酸给药浓度的筛选结果

结果（图2）显示，与Control组比较，LPS处理组培养基中TNF-α、IL-1β水平显著升高（P＜0.05）；与LPS处理组比较，0.01、0.1、1 μmol/L绿原酸干预组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P＜0.05）。与Control组比较，LPS处理组细胞中iNOS蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与LPS处理组比较，0.1 μmol/L绿原酸干预组细胞中iNOS蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与0.1 μmol/L绿原酸干预组比较，1 μmol/L绿原酸干预组细胞中iNOS表达水平显著升高（P＜0.05），结果见图3A。与LPS处理组比较，0.1 μmol/L绿原酸干预组细胞中TREM2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），结果见图3B。此外，上述各处理组间细胞活力比较差异无统计学意义（P＞0.05），结果见图4。以上结果表明，0.1 μmol/L绿原酸可显著抑制LPS对巨噬细胞的激活，并提高TREM2蛋白表达水平，且未对细胞增殖产生显著影响，故本研究选择浓度为0.1 μmol/L的绿原酸进行后续实验。

图2 不同浓度绿原酸对巨噬细胞中TNF-α、IL-1β水平的影响（±s，n＝8）

图3 不同浓度绿原酸对巨噬细胞中iNOS、TREM2蛋白表达水平的影响（±s，n＝4）

图4 不同浓度绿原酸对巨噬细胞活力的影响（±s，

3.3 TREM2在绿原酸抑制巨噬细胞激活中的作用

3.3.1 转染TREM2-siRNA对巨噬细胞中TREM2蛋白表达水平的影响

结果（图5）显示，TREM2-siRNA可显著降低细胞TREM2蛋白表达水平（P＜0.05），表明TREM2-siRNA的干扰有效，可用于后续实验。

图5 转染TREM2-siRNA干扰细胞TREM2蛋白表达效果验证的电泳图

3.3.2 干扰TREM2表达后对TNF-α、IL-1β水平的影响

与Control组比较，LPS处理组培养基中TNF-α、IL-1β水平均显著升高（P＜0.05）；与LPS处理组比较，绿原酸+LPS组培养基中TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P＜0.05）；与绿原酸+LPS组比较，TREM2-siRNA+绿原酸+LPS组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平均显著升高（P＜0.05），而SC-siRNA未对绿原酸抑制TNF-α和IL-1β释放的作用产生显著影响（P＞0.05）。结果见图6。

图6 干扰TREM2表达对TNF-α、IL-1β水平的影响（±s，n＝8）

3.3.3 干扰TREM2表达对iNOS蛋白染色情况的影响

结果（图7）显示，LPS可明显增加巨噬细胞中iNOS蛋白表达水平（红色），绿原酸可明显降低iNOS蛋白表达水平，TREM2-siRNA显著逆转了绿原酸对iNOS蛋白表达水平的抑制作用，而SC-siRNA未对iNOS的蛋白表达水平产生明显影响。

图7 干扰TREM2表达对iNOS蛋白表达影响的免疫荧光染色图

3.3.4 干扰TREM2表达对TREM2、NF-κB p65和iNOS蛋白表达水平的影响

与Control组比较，LPS处理组细胞中iNOS和NFκB p65蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与LPS处理组比较，绿原酸+LPS组细胞中iNOS和NF-κB p65蛋白表达水平均显著降低、TREM2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与绿原酸+LPS组比较，TREM2-siRNA+绿原酸+LPS组细胞中iNOS和NF-κB p65蛋白表达水平均显著升高、TREM2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），TREM2-siRNA明显逆转了绿原酸的上述作用；而SCsiRNA未对绿原酸产生的上述作用造成影响。以上结果表明，绿原酸可通过巨噬细胞TREM2介导，降低LPS引起的巨噬细胞激活。结果见图8、图9。

图8 干扰TRME2表达对TREM2和NF-κB p65表达的影响（±s，n＝4）

图9 干扰TRME2表达对iNOS表达的影响（±s，n＝4）

4 讨论

现代医学研究发现，绿原酸具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化和心血管保护等作用[10]，但目前其作用机制尚不十分明确，这也大大限制了绿原酸的临床应用。巨噬细胞是一种分布于人体血液循环和肺内的免疫细胞，在炎症反应过程中，巨噬细胞受到刺激后，可分泌大量促炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，高浓度的促炎性细胞因子可增强人体内的炎症反应程度，对心、脑、肾、肝等多个脏器造成损伤。若巨噬细胞的引起的炎症反应得不到有效控制，可引起全身炎症反应综合征，甚至导致死亡[11]。因此，控制或抑制巨噬细胞的过度激活，被认为是治疗炎症相关疾病的关键环节。目前研究发现，巨噬细胞激活后可处于2种状态：经典激活状态（M1状态）和选择性激活状态（M2状态）。M1状态的巨噬细胞目前认为是有害的，而M2状态的巨噬细胞被认为是有益的。因此，将巨噬细胞调控至M2状态是治疗这类炎症反应相关疾病的关键环节[12—13]。本课题组使用LPS刺激巨噬细胞，引起细胞激活，观察使用绿原酸后对LPS引起巨噬细胞激活水平的影响。结果发现，绿原酸可显著减弱LPS对巨噬细胞的激活作用，降低巨噬细胞的炎症反应程度。促炎性细胞因子（如TNF-α和IL-6）分泌增加和iNOS蛋白表达上调，表明巨噬细胞处于M1激活状态；而绿原酸降低了巨噬细胞促炎性细胞因子分泌和iNOS蛋白表达水平，说明该药物减少了处于M1激活状态的巨噬细胞数量，具有明显的抗炎能力[14]。由于NFκB调控了很多炎症反应相关的基因，且巨噬细胞促炎性细胞因子分泌水平的高低，受NF-κB蛋白表达水平调控[14]，因此，本研究检测了巨噬细胞中NF-κB p65的蛋白表达水平。结果发现，LPS刺激可明显升高巨噬细胞中NF-κB p65蛋白表达水平，而绿原酸可明显抑制LPS引起的NF-κB p65蛋白表达上调。以上结果表明，绿原酸可抑制LPS引起的巨噬细胞炎症反应。

髓样细胞触发受体（TREM）是在2000年被发现的一类免疫球蛋白超家族，目前已知TREM家族有3个成员，分别为TREM1、TREM2和TREM3[15]。其中，TREM1和TREM2是目前研究较多的2个TREM家族成员，其结构较为相似，但其功能大有不同——TREM1对炎症反应起着促进和放大的作用，而TREM2对炎症反应起着抑制的作用。研究表明，TREM2表达上调可抑制免疫细胞分泌炎症因子，减轻炎症损伤[16]。研究表明，TREM2基因敲除肺炎模型小鼠与野生型小鼠相比，前者肺炎的严重程度和死亡率显著降低，其机制可能是肺泡巨噬细胞上的TREM2基因敲除后，细胞吞噬能力显著增加，清除细菌等病原微生物的能力增强[17]。另一项研究表明，与巨噬细胞特性类似的小胶质细胞，其TREM2表达上调后，可显著抑制小胶质细胞激活，通过改善小胶质细胞激活状态，即降低M1状态的细胞数量，增加M2状态的细胞数量，减轻脑组织缺血后的炎症反应程度[17]。TREM2是调控炎症细胞（包括小胶质细胞和巨噬细胞）激活状态的重要靶点。早期研究提示，TREM2上调可抑制免疫细胞过度激活，从而抑制促炎性细胞因子分泌，最终降低炎症反应程度[7]。国外也有研究表明，TREM2可通过减轻巨噬细胞激活，减轻炎症反应[18]。在本研究中，研究者采用TREM2-siRNA干扰巨噬细胞的TREM2蛋白表达后，绿原酸在巨噬细胞中产生的抗炎作用被显著逆转。以上结果表明，绿原酸在LPS刺激下的巨噬细胞中产生的抑炎作用，可能是通过细胞上的TREM2蛋白介导的。

综上所述，绿原酸可显著抑制LPS对巨噬细胞的激活，其抗炎作用可能是通过巨噬细胞上的TREM2蛋白介导的。但本研究也有一些不足之处：首先，本研究采用巨噬细胞系作为研究对象，所得结论并非来源于动物或临床研究结果；其次，本研究仅观察了TREM2蛋白的作用，TREM1或TREM3在绿原酸抑制巨噬细胞激活中是否发挥了作用尚不明确。因此在后续研究中，还应采用更多实验对本研究结果进行进一步验证，并探索其更多的作用机制。