槲皮素对小鼠单侧输尿管结扎致肾间质纤维化的改善作用及机制研究

黎 艳,刘 莉,王琪文,杨 越,张 静,刘 丹

(1.荆门市人民医院 荆楚理工学院附属中心医院,湖北 荆门 448000;2.西安市第五医院,陕西 西安 710082;3.上海市浦东医院 复旦大学附属浦东医院风湿免疫科,上海 201399)

慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD) 的发病率逐年增加,已经是一个重要的全球性的公共卫生问题,是现今危害人类健康的主要疾病之一。CKD如果早期不及时地干预可进展为终末期肾病,而肾间质纤维化几乎是所有CKD进展到终末期肾病(End stage renal disease,ESRD) 的共同病理途径[1]。防止和延缓肾间质纤维化是防治CKD进展的关键。槲皮素(Quercetin)是多羟基黄酮类化合物,广泛分布在植物和多种中草药中具有生物活性的黄酮类物质,多数情况以苷形式存在,经水解后可以得到槲皮素,具有多种生物学活性及药用价值[2]。已有研究[3-5]证明,槲皮素药理作用十分广泛,具有清除自由基和抗氧化作用,通过抗氧化应激、抗炎等作用对肾脏起保护作用。因此,为了探讨该化合物对肾脏纤维化的作用,我们观察槲皮素对单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠肾间质纤维化的影响并进一步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 试 剂 槲皮素(上海源叶,中国);Trizol(Invitrogen,美国); 逆转录试剂盒(Thermo,美国);通用型SYBR®Green预混液(Applied Biosystems,美国);Anti-CD45抗体、Anti-α-SMA抗体、抗β肌动蛋白抗体(Anti-βactin antibody)(Abcam,美国); Anti-TGF-β1抗体(Santa Cruz,美国);血肌酐检测试剂盒(肌氨酸氧化酶法)、尿素氮检测试剂盒(BioAssay,美国);PVDF膜(Merck,美国);羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP、RIPA 裂解液、脱脂奶粉、TBST缓冲液、DAB显色试剂盒、天狼星红染色试剂盒、糖原PAS染色试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(索莱宝,中国)。

1.2 仪 器 酶联免疫检测仪 (Thermo,美国);Light Cycler®96实时荧光定量 PCR仪 (Roche,美国);CKX53倒置荧光显微镜(Olympus,日本)。

1.3 UUO造模及分组 将48只C57/B6健康雄性小鼠随机分为四组,对照组、低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组。对照组戊巴比妥钠腹腔麻醉后仅行腹膜切开缝合,不行输尿管结扎;给药组戊巴比妥钠腹腔麻醉后均行右侧输尿管结扎术,分别在术后第14天处死小鼠[6]。对照组在术后当天开始给予皮下注射0.9%氯化钠溶液,低剂量给药组在术后当天开始给予皮下注射槲皮素3 mg/(kg·d),中剂量给药组在术后当天开始给予皮下注射槲皮素9 mg/(kg·d),高剂量给药组在术后当天开始给予皮下注射槲皮素 18 mg/(kg·d),至术后第14天。各组小鼠于当日收尿,经40 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔麻醉后收血,开腹切取右侧肾组织分成3部分,其中2部分迅速存于液氮中;第3部分固定于4%多聚甲醛,石蜡包埋。

1.4 血肌酐、尿素氮检测 血肌酐采用肌氨酸氧化酶法检测,尿素氮采用脲酶法检测,均严格按照试剂盒说明书完成。

1.5 PAS染色、天狼星红染色 石蜡组织切片行PAS染色、天狼星红染色。双盲法应用Image J图像分析软件对图像进行分析。

1.6 免疫组化染色 石蜡切片水化后置枸橼酸缓冲液 (pH 6.0)中微波修复抗原,用0.3%过氧化氢甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶,加抗体Anti-CD45,于4 ℃孵育过夜,用正常山羊血清作为阴性对照, DAB显色阳性产物呈棕色,甘油明胶封片。双盲法采用Image J图像分析软件对图像进行分析,比较肾脏组织白细胞浸润程度。

1.7 RT-qPCR法检测基因表达 肾组织液氮速冻研磨后,加入1 ml Trizol裂解细胞,再加入200 μl氯仿,4 ℃,12000 g离心15 min,加入等体积异丙醇,4 ℃,12000 g离心10 min,按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录和扩增反应,引物由上海生工合成。肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因上游引物:5’-TGAGCACAGAAAGCATGATCC -3’,下游引物:5’-GCCATTTGGGAACTTCTCATC-3’;白细胞介素6(IL-6)基因上游引物:5’- GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3’,下游引物:5’-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3’;α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因上游引物:5’-GCTGGTGATGATGCTCCCA-3’,下游引物:5’- GCCCATTCCAACCATTACTCC-3’;胶原蛋白1 (COL-1)基因上游引物:5’- TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3’,下游引物:5’-GTTCGGGCTGATGTACCAGT-3’;纤连蛋白(FN)基因上游引物:5’-GAAGTCGCAAGGAAACAAGC-3’,下游引物:5’- GCATCGTAGTTCTGGGTGGT-3’;GAPDH内参基因上游引物:5’- CGTCCCGTAGACAAAATGG -3’,下游引物:5’- TTGATGGCAACAATCTCCAC -3’。TNF-α、IL-6、α-SMA扩增反应程序:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性60 s,56 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,共30个循环,72 ℃延伸10 min;Collagen 1、Fibronectin 扩增反应程序:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性60 s,53 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,共30个循环,72 ℃延伸10 min。定量 PCR结果通过2-ΔΔCt计算。

1.8 Western blot检测蛋白表达 用RIPA 裂解液裂解组织提取总蛋白,提取的总蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳,采用电转将蛋白转移到PVDF膜上,加5%脱脂奶粉室温封闭1 h,分别加入α-SMA抗体(1∶200),TGF-β1抗体(1∶300),4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3次,每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶300),室温孵育1 h,洗膜后显影成像,并计算光密度强度。

2 结 果

2.1 槲皮素对 UUO 小鼠血生化指标的影响 血生化指标结果表明,术后14 d,对照组与低剂量和中剂量给药组相比小鼠血肌酐、尿素氮水平差异无统计学意义(均P>0.05),高剂量给药组明显较对照组、低剂量和中剂量给药组低(均P<0.05),见表1。因此,后续实验将选择高剂量给药组进行研究。

表1 槲皮素对 UUO 小鼠血生化指标的影响

2.2 槲皮素对 UUO 小鼠肾脏组织学的影响 PAS染色结果提示,UUO术后14 d,对照组肾脏组织肾间质单核细胞浸润增多,出现明显纤维化,肾脏组织间质区域大量细胞外基质成分沉积,而槲皮素高剂量给药组肾脏病变均不明显(图1)。槲皮素治疗后UUO小鼠肾脏损伤程度减轻。天狼星红染色结果显示,UUO术后14 d,高剂量给药组肾小管萎缩程度和肾间质纤维化较对照组明显减轻(图2)。因此,槲皮素治疗后可显著减轻肾间质纤维化程度。

注:**P<0.01图1 PAS染色观察槲皮素处理后肾脏病理损伤程度(×200)

注:***P<0.001图2 天狼星红染色观察槲皮素处理后肾脏纤维化程度(×200)

2.3 槲皮素对 UUO 小鼠肾组织炎症因子及纤维化因子mRNA表达水平的影响 RT-qPCR结果显示,同对照组相比,高剂量给药组肾组织中各炎症因子(TNF-α、IL-6)和纤维化因子(COL-1、FN和α-SMA)的mRNA表达明显降低(均P<0.05)(图3)。结果提示,高剂量槲皮素治疗能够显著抑制细胞炎症浸润和纤维化程度。

注:*P<0.05,**P<0.01图3 槲皮素对UUO小鼠肾组织炎症因子及纤维化因子mRNA表达水平的影响

2.4 槲皮素对 UUO 小鼠肾组织炎症细胞浸润程度的影响 取肾脏组织进行炎症细胞免疫组化染色,免疫组化结果显示,阳性染色主要表达在肾脏小管间质区域,与对照组相比,高剂量给药组肾组织中CD45表达明显降低(P<0.01)(图4)。结果表明,高剂量槲皮素治疗能够显著减少肾脏组织中炎症细胞浸润,降低炎性反应程度。

注:**P<0.01图4 CD45染色观察槲皮素处理后白细胞浸润程度(×200)

2.5 槲皮素对UUO小鼠肾组织 TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平的影响 Western blot结果显示,与对照组相比,高剂量槲皮素给药组可下调UUO小鼠 TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平(均P<0.05)(图5)。结果表明,槲皮素能够降低UUO小鼠肾组织纤维化水平和炎性反应程度。

3 讨 论

慢性肾脏病的发病率在我国呈逐年增高的趋势,已然成为我国公共卫生重大问题。既往研究[7]表明,慢性肾脏病引起的肾间质纤维化病变是决定肾脏存活率的最主要因素,然而目前临床上应用的药物对抗纤维化治疗而带来的不良反应往往限制了它们的使用,因此对肾间质纤维化的治疗方案十分有限。肾间质纤维化的进程涉及多条信号通路、多种细胞因子,是一个多步骤多因素的病理过程。而中医药在复杂疾病的治疗中占有优势,大量的研究也证实了中药复方及单味中药干预氧化应激相关信号通路延缓肾间质纤维化的进展[8]。既往研究[9]表明,槲皮素可通过抗氧化应激、抗炎作用等对肾脏起保护作用。因此,探究槲皮素对肾脏纤维化和炎症发病的信号通路机制尤为重要。

肾间质纤维化以肾小管间质内细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的大量积聚、成纤维细胞大量增生、肾小管萎缩以及间质炎性细胞浸润为主要特征,是各种原发或继发性肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径[10]。UUO 小鼠是以进行性肾小管间质纤维化为特征的实验性肾脏病模型,是目前公认的肾小管间质纤维化模型,相关研究已经证实UUO 小鼠在术后第14天已出现较为明显的肾小管间质纤维化[11]。因此,本文通过槲皮素对输尿管结扎后14 d小鼠肾脏纤维化程度的治疗作用进行实验探究。

通过组织形态学研究发现,高剂量槲皮素可明显改善UUO小鼠肾脏组织肾小管上皮细胞形态,减轻肾脏损伤程度,并且通过天狼星红染色表明纤维化程度也明显减轻。同时,我们检测了药物治疗后肾脏组织中炎症因子和纤维化因子的表达,发现高剂量槲皮素能够明显减轻肾间质炎症细胞的浸润和肾脏组织纤维化程度。发生肾间质纤维化的肾小管及间质细胞表达α-SMA[12]。肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化是肾脏纤维化的重要进展环节,正常条件下,成熟的肾小管上皮细胞表达角蛋白,肾间质细胞主要表达波形蛋白,其都没有α-SMA 蛋白的表达[13-14]。TGF-β1是最重要的促纤维化细胞因子之一,TGF-β1信号途径在上皮细胞间充质转分化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)中的重要作用已得到公认[15-16]。既往研究也证实抑制梗阻侧肾组织中TGF-β1的表达,可以对抗肾间质纤维化的发生进展[17]。因此,槲皮素通过下调UUO小鼠肾组织TGF-β1表达水平和α-SMA蛋白表达,降低纤维化水平。

槲皮素对肾损伤的治疗作用和抗纤维化作用可能是通过抑制TGF-β1/Smad通路[18-19],进而调控肾间质成纤细胞(renal intestinal fibroblast,RIF)活化来完成的[20]。现有的体外研究结果表明,槲皮素在TGF-β1诱导的大鼠正常肾成纤维细胞(NRK-49F细胞)活化中发挥抑制作用,并且随着α-SMA下调的同时,糖酵解途径中的关键酶丙酮酸激酶同工酶2(Pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2)的基因表达水平和蛋白表达水平均下调,且与槲皮素剂量呈正相关[21]。综上所述,槲皮素可能是通过抑制糖酵解,下调TGF-β1表达,减少肾间质成纤细胞活化抑制肾纤维化的进程。

槲皮素可以改善UUO小鼠肾间质纤维化指标以及血肌酐和尿素氮含量,其机制可能是通过降低炎症细胞浸润,并通过下调α-SMA和TGF-β1蛋白表达,改善肾小管上皮细胞间充质转化,从而减轻纤维化程度。