circFAM73A靶向调控miR-140-3p对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞凋亡、迁移和炎症因子释放的影响

李伟华,安书杰,孟 华,沙南希,王双勇

(1.空军军医大学西京医院综合诊疗科,陕西 西安 710032;2.广州医科大学附属第三医院眼科,广东 广州 510150)

糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病患者最常见的眼部并发症之一,主要是由于高血糖导致视网膜血管异常和新生血管形成,从而引起视网膜水肿、出血、视网膜缺血等病变[1-2]。人视网膜血管内皮细胞在糖尿病视网膜病变中发挥了重要的作用[3]。人视网膜血管内皮细胞是视网膜血管的内层细胞,维持着视网膜血管壁的完整性和正常功能。在高血糖条件下,人视网膜血管内皮细胞受到损伤,导致血管内皮细胞功能障碍和血管通透性增加,从而加速了DR的发展[4-5]。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类环形RNA分子,具有稳定性和广泛的表达特点[6]。最近的研究[7]表明,circRNA在DR的发生和发展中也发挥了重要作用。研究[8-9]发现circRNA参与了视网膜神经元凋亡、视网膜神经胶质细胞激活、视网膜毛细血管损伤等过程。研究[10]显示circFAM73A在DR中显著高表达,然而其具体作用和调控机制尚未完全明确。因此,本研究主要探讨circFAM73A对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡、迁移和炎症因子释放的影响,及对circFAM73A/miR-140-3p轴的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 DMEM/F12细胞培养基(美国Life Technologies Corporation公司),Trizol试剂(美国生命技术公司),RNA反转录试剂盒(日本Takara公司),Lipofectamine 3000和Protein A磁珠(美国Invitrogen公司),Transwell小室(Chemicon公司),HRP标记的羊抗兔IgG抗体(美国CST公司),RIP RNA试剂盒(美国Millipore公司),细胞凋亡试剂盒(中国上海弗元生物科技有限公司),Dual Luciferase Reporter Assay试剂盒(美国Promega公司),兔抗人TNF-α、IL-6和Cleaved caspase 3抗体(美国Sigma-Aldrich公司)。引物由中国上海生工合成,质粒由中国上海吉凯基因公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养与转染:人视网膜血管内皮细胞购自美国ATCC细胞库,采用含有10% FBS、100 U/ml链霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培养基,在5% CO2、37 ℃的条件下培养。当细胞密度达到70%～80%时,进行下一步实验。细胞分为正常葡萄糖(NG)组和高葡萄糖(HG)组,葡萄糖干预浓度分为5.5 mmol/L和25 mmol/L。细胞转染采用Lipofectamine 3000,将100 nmol/L的circFAM73A小干扰RNA(si-circFAM73A)、miR-140-3p inhibitors及相应阴性对照转染至细胞中。转染48 h后,进行后续实验。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR):采用Trizol试剂提取人视网膜血管内皮细胞RNA样本,使用RNA反转录试剂盒对circRNA和mRNA进行逆转录,使用miRNA反转录试剂盒对miRNA进行逆转录。qPCR反应使用实时荧光定量PCR试剂盒(适用于circRNA和mRNA)和miRNA荧光定量PCR试剂盒(适用于miRNA)进行。以GAPDH(circRNA和mRNA)或U6(miRNA)作为内参并通过2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.6 荧光素酶报告基因检测:将野生型(WT)和突变型(MUT)3’-UTR circFAM73A的双荧光素酶报告基因质粒与miR-140-3p mimic/nc mimic同时转染入人视网膜血管内皮细胞中,并孵育48 h。随后使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性,并以Renilla荧光素酶活性作为内参测量荧光素酶活性。

2014年5月30日，由中国水利学会联合禹城大禹文化研究会、国际生态安全合作组织、全联环境服务业商会、水利部科技推广中心共同主办的“中国（国际）水务高峰论坛——2014中国·禹城水生态文明建设论坛”在山东禹城开幕。此次论坛主题为“水生态文明建设与县域经济”，来自全国相关政府部门、权威机构、学术单位的专家学者以及企业代表300余人齐聚一堂，共谋水生态文明建设之道。

1.2.4 迁移实验:细胞被用预冷PBS洗涤两次,然后在无血清的DMEM中稀释到1×104/ml的细胞悬液。接下来,将Transwell小室插入24孔板中,基底腔包含含有10% FBS的培养基,而上面腔则包含细胞悬液。培养48 h后迁移的细胞被100%甲醇固定30 min,然后用0.1%结晶紫染色,倒置显微镜下观察每个孔的五个随机视野中迁移的细胞数。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析。本研究的所有数据均以平均值±标准差表示,实验至少重复进行了3次,使用Student’st检验或单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较,使用Tukey的事后检验进行多重比较;P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡:细胞转染后采用PBS洗涤2次,在暗室中同时用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染色15 min。使用FC-500流式细胞仪识别FITC+和PI+/-的凋亡细胞,并计算各组细胞凋亡率。

circRNA能够通过多种途径调节人视网膜血管内皮细胞功能和DR的发展[11]。最常见的调控方式为circRNA作为miRNA的“海绵”吸附miRNA,从而影响miRNA的功能;另外部分circRNA则可以与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)相互作用,调节人视网膜血管内皮细胞基因表达和蛋白翻译;此外,还有部分circRNA与表观遗传修饰相关,可以影响人视网膜血管内皮细胞基因表达和功能[12-13]。而人视网膜血管内皮细胞在维持视网膜血管壁结构和功能上发挥着关键的作用[14]。高血糖状态下,视网膜血管内皮细胞的功能异常,会导致视网膜微循环障碍,进而引发糖尿病视网膜病变[15]。因此,调控人视网膜血管内皮细胞生物学功能对控制DR进展具有重要作用。

1.2.5 Western blot:采用RIPA裂解缓冲液提取细胞中的总蛋白质,然后用BCA蛋白质浓度检测试剂盒测定蛋白质的浓度。将蛋白质通过10%的SDS-PAGE电泳分离,并将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。5% 脱脂牛奶封闭膜 2 h,使用含有 0.1% Tween-20 (TBST) 的 TBS 洗涤 ,然后在4 ℃下与一抗共同孵育过夜。第2天,将膜与二抗一起在25 ℃下孵育2 h。使用ECL试剂盒来分析蛋白质的表达水平。其中,GAPDH作内参计算各组蛋白相对表达量。

2 结 果

2.3 circFAM73A能够靶向结合miR-140-3p 为验证circFAM73A对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞生物学功能的具体作用机制。circFAM73A和miR-140-3p存在结合位点(图3A),双荧光素酶基因报告结果显示circFAM73A-WT组中转染miR-140-3p mimics后双荧光素活性明显下降(图3B,P<0.05),RIP结果显示circFAM73A和miR-140-3p能够结合Ago2蛋白,在转染miR-140-3p mimics能够增加Ago2蛋白和circFAM73A的结合(图3C,P<0.05)。miR-140-3p的表达水平在HG组显著降低(图3D,P<0.05),在HG组转染si-circRNA FAM73A后,miR-140-3p的表达水平明显高于HG+si-nc组(图3D,P<0.05)。这提示circFAM73A能够通过ceRNA机制靶向结合miR-140-3p。

注:**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001A:RT-qPCR检测circFAM73A表达水平;B、C:流式细胞术检测细胞凋亡情况;D、E:Western blot检测凋亡相关分子Cleaved caspase 3表达水平图1 circFAM73A对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

布鲁诺走下法庭前又转过身来大声说道：“我看见了，你们在宣判时比我更害怕！”这声音嗡嗡地在教堂里回响。主教们赶忙擦着汗，夹起文件匆勿散去。

2.2 circFAM73A对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞迁移和炎症因子释放的影响 HG组细胞迁移(图2A,P<0.05)和炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平(图2B、C,P<0.05)明显高于NG组,HG+si-circRNA FAM73A组细胞迁移(图2A,P<0.05)和炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平(图2B、C,P<0.05)明显低于HG+si-nc组。这提示沉默circFAM73A能够显著抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞迁移和炎症因子TNF-α和IL-6的释放。

注: ****P<0.0001A:Transwell检测细胞迁移情况;B、C:RT-qPCR检测炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA表达水平图2 circFAM73A对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞迁移和炎症因子释放的影响

2.1 circFAM73A对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响 对人视网膜血管内皮细胞分别采用5.5 mmol/L葡萄糖(NG组)或25 mmol/L葡萄糖(HG组)处理细胞,同时在HG组分别转染si-nc(HG+si-nc组)和si-circRNA FAM73A(HG+si-circRNA FAM73A组)。结果显示circFAM73A的表达水平在HG组显著升高(图1A,P<0.05),在HG组转染si-circRNA FAM73A后,circFAM73A的表达水平明显低于HG+si-nc组(图1A,P<0.05)。在人视网膜血管内皮细胞凋亡上,HG组细胞凋亡率明显高于NG组(图1B、C,P<0.05),HG+si-circRNA FAM73A组细胞凋亡率明显低于HG+si-nc组(图1B、C,P<0.05);HG组细胞凋亡相关分子Cleaved caspase 3的表达水平明显高于NG组(图1D、E,P<0.05),HG+si-circRNA FAM73A组细胞凋亡相关分子Cleaved caspase 3的表达水平明显低于HG+si-nc组(图1D、E,P<0.05)。这提示沉默circFAM73A能够显著抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡。

Seepage calculation and discussion of double drainage blind ditch in finite thickness aquifer YE Kun WANG Xian-neng(68)

注:****P<0.0001A:circFAM73A和miR-140-3p结合位点;B、C:双荧光素酶报告和RIP实验证实circRNA FAM73A能够靶向结合miR-140-3p;D:RT-qPCR检测miR-140-3p表达水平图3 circFAM73A能够靶向结合miR-140-3p

2.4 circFAM73A/miR-140-3p轴对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡、迁移和炎症因子释放的影响 为验证circFAM73A/miR-140-3p轴对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞生物学功能的影响,在高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞中分别转染si-circRNA FAM73A(HG+si-circRNA FAM73A组)、miR-140-3p inhibitors(HG+miR-140-3p inhibitors组)和si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors(HG+si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors组)。结果显示低表达miR-140-3p能够显著促进高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡(图4A、B,P<0.05)、凋亡相关蛋白Cleaved caspase 3的表达水平(图4C、D,P<0.05)、迁移(图4E、F,P<0.05)、炎症因子TNF-α和IL-6的释放(图4G、H,P<0.05)。共转染si-circRNA FAM73A和miR-140-3p inhibitors能够显著减弱单独转染miR-140-3p inhibitors对人视网膜血管内皮细胞凋亡(图4A、B,P<0.05)、凋亡相关蛋白Cleaved caspase 3的表达水平(图4C、D,P<0.05)、迁移(图4E、F,P<0.05)、炎症因子TNF-α和IL-6的释放(图4G、H,P<0.05)。这提示circFAM73A能够通过靶向结合miR-140-3p调控高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡、迁移和炎症因子释放。

社会大众借助社会化媒体，比如微信、微博等媒体平台将信息快速传播出去。在其他社会受众对照片或视频进行转发评论的同时，社会信息的传播实现了更加多样化的传播。在文字和照片以及信息的传播过程中，信息得到及时交互，传受关系得到进一步扩散[1]。但实际上，网上的关系并不是一种人际关系，这是一种新型的社会角色关系，当这种关系借助手机和社会化媒体发展，媒介融合的特质也得到进一步显现，社会化媒体中的用户关系和用户地位也会随时发生改变。

3 讨 论

1.2.7 RNA免疫沉淀(RIP):收集培养的人视网膜血管内皮细胞,并用RIP裂解缓冲液重悬。接下来,将细胞提取物与含有抗Ago2抗体或小鼠免疫球蛋白G(IgG)对照结合的磁珠RIP缓冲液在4 ℃下孵育过夜。次日,洗涤磁珠3次,并将磁珠与蛋白酶K一起孵育。使用Trizol试剂从提取物中分离出总RNA。最后,通过RT-qPCR分析确定circFAM73A和miR-140-3p的相对富集量。

在糖尿病患者中,高血糖水平会导致视网膜血管内皮细胞凋亡的增加,这会引起视网膜缺血、缺氧和代谢紊乱,从而诱发新生血管生成和病变进展[16-17]。研究显示circSLC16A12可以调控miR-140-3p/FGF2轴抑制视网膜血管内皮细胞凋亡,进而减缓DR的进展[18]。circVEGFC能够通过miR-338-3p/HIF-1α/VEGFA轴加重高糖诱导的血管内皮细胞凋亡[19]。本研究结果显示circFAM73A的表达水平高糖处理的人视网膜血管内皮细胞中明显高表达,高糖能够明显诱导人视网膜血管内皮细胞凋亡,而沉默circFAM73A能够显著抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡。

总之，列宁“政治遗嘱”中关于领导干部政治品格、大局意识和专业素质等方面的要求，指向的是当时俄共（布）的干部队伍，对今天我们党加强干部队伍建设仍然具有重要的启发意义。面对新形势、新任务，我们党在要求领导干部学习马列主义、毛泽东思想，提高政治理论素养的同时，也要高度重视领导干部的专业知识学习，使他们全面提高业务素质。正如习近平总书记所强调的，领导干部要“结合工作来学习，不断提高自己的知识化、专业化水平。要坚持干什么学什么、缺什么学什么，有针对性地学习掌握好领导工作、履行岗位职责所必备的各种知识，努力使自己成为行家里手、内行领导”[2]405。

在糖尿病患者中,视网膜血管内皮细胞迁移增加,血管生成加速,血管通透性增加,细胞外基质合成和降解失衡,导致了视网膜微血管的结构和功能的改变[20-21]。同时,在DR中高血糖会诱导视网膜血管内皮细胞的炎性反应,促进白细胞黏附和渗出,导致视网膜水肿、出血和缺氧等病理改变[20]。研究显示沉默circ-UBAP2能够通过调控miR-589-5p/EGR1轴抑制视网膜微血管内皮细胞迁移和氧化应激,继而抑制DR进展[22]。研究显示抑制circ-0002570可以通过miR-1243/angiomotin轴抑制高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞的血管生成和炎性反应[10]。在本研究中,高糖能够明显诱导人视网膜血管内皮细胞迁移和炎症因子TNF-α和IL-6的释放,而沉默circFAM73A能够显著抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞迁移和炎症因子TNF-α和IL-6的释放。这提示circFAM73A参与了高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡、迁移和炎症因子释放。

为进一步探讨circFAM73A对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞生物学功能的具体作用机制,双荧光素酶报告和RIP实验证实circRNA FAM73A能够靶向结合miR-140-3p。miR-140-3p的表达水平在高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞中显著降低,沉默circRNA FAM73A能够促进miR-140-3p的表达,这提示circFAM73A能够通过ceRNA机制靶向结合miR-140-3p。研究显示circ-0128846能够通过ceRNA机制靶向结合miR-140-3p调控骨关节炎的进展[23]。circRNA-0088036 能够通过ceRNA机制靶向结合miR-140-3p促进膀胱癌的进展[24]。

随着一批批商业银行的成功上市和市场竞争的加剧，银行正在走向市场主导型的营销模式，也加快了我国商业银行营销模式的转变进程[4]。但是，在营销战略和观念上，这种观念的转变还不够彻底。外资银行在进入中国市场后一般采取轻表内业务、重表外业务；轻传统存贷业务、重现代创新业务；轻市场份额、重盈利增长和轻负债业务、重资产业务的重点化竞争战略。相对外资银行来说，我国城市商业银行利润的主要来源仍旧是传统的存贷业务，因此，我国的城市商业银行在一定程度上仍旧墨守过去的营销策略和营销理念。

研究显示miR-140-3p在DR中显著低表达,circRNA-0084043能够通过靶向结合miR-140-3p促进高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡、氧化应激和炎症因子释放[25]。本研究在恢复实验中,在高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞中分别转染si-circRNA FAM73A、miR-140-3p inhibitors和si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors。结果显示低表达miR-140-3p能够显著促进高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡、迁移、炎症因子TNF-α和IL-6的释放;共转染si-circRNA FAM73A和miR-140-3p inhibitors能够显著减弱低表达miR-140-3p对人视网膜血管内皮细胞凋亡、迁移和炎症因子释放的作用。因此,沉默circFAM73A能够通过靶向结合miR-140-3p抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡、迁移和炎症因子释放。