白藜芦醇对慢性阻塞性肺疾病大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB信号通路的影响

吴文婷,李 敏,蒲文娟

(空军军医大学唐都医院呼吸与危重症医学科,陕西 西安 710038)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种由于气道或肺泡异常所引起的气流受限的慢性呼吸道疾病,被认为是“沉默的杀手”,已成为全球第四大致死疾病[1-3]。在我国COPD约有1亿人,40岁以上人群患病率达13.7%,每年死亡病例超100万例,是我国第三大疾病死因,对患者、国家、社会造成沉重经济负担和卫生资源消耗,因此已成为重要的公共卫生问题[4]。目前COPD的治疗手段尚不能令人满意,深入探讨COPD发病机制、寻找新的治疗药物意义重大。白藜芦醇是一种广泛存在于藜芦、葡萄、虎杖等植物中的多酚类化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用,在COPD的抗炎治疗中发挥重要作用[5-6]。因此本研究将采用烟雾联合脂多糖诱导法使SD大鼠被动吸烟建立COPD模型,探讨白藜芦醇对COPD大鼠肺组织病理、炎症因子、氧化水平的影响及相关机制,为COPD的临床治疗及科研工作探索新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 上海斯莱克实验动物有限责任公司提供的50只(200±20)g的SD雄性大鼠,合格证书为SCXK(沪)2021-0002,并饲养于环境温度为(20±2)℃条件下,自由饮食和摄水。本实验通过本院的伦理审查。

1.2 主要试剂及仪器 白藜芦醇购自美国Sigma公司;兔抗p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB抑制因子α(IκB α)、核因子-κB p65(NF-κB p65)及GAPDH多克隆抗体购自美国Abcam公司;超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒均自武汉博士德生物技术有限公司。ELX800酶标分析仪购自美国Bio-Tek公司;Chemi DocTMXRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司。

1.3 建模及分组[7-9]50只大鼠采用随机数字法分为正常组,模型组,白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇中剂量组、白藜芦醇高剂量组,每组10只。模型组、白藜芦醇组均采用烟熏联合气管内滴加脂多糖建立COPD大鼠模型:在造模的第1、14天将大鼠麻醉,固定于操作台,向大鼠气管缓慢注入200 μg/ml(200 μl)脂多糖,结束后大鼠直立旋转15 s,以使脂多糖均匀分布于大鼠肺部。在造模的第2～13天,第15～28天每天将大鼠置于制作好的透明的烟熏箱(120 cm×80 cm×80 cm,有1个进烟孔、2个排烟孔)中进行烟雾暴露,持续吸入香烟烟雾1 h/d,至第28天结束。使用肺功能测定仪检测大鼠肺功能,并观察大鼠肺组织病理变化来判断造模是否成功。正常组大鼠于第1、14天气管内注入于200 μl 0.9%氯化钠溶液外,其余时间常规饲养。第29天开始进行干预,白藜芦醇低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予5、15、45 mg/(kg·d)白藜芦醇,正常组及模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液,连续28 d。

1.4 HE染色观察肺组织病理变化 石蜡包埋肺组织并切片,厚度约为4 μm,60 ℃烘烤40 min。二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水。蒸馏水浸泡后,苏木素浸泡1 min,流水洗涤5 min。盐酸乙醇分化5 s,伊红溶液染色20 s,流水洗涤5 min。梯度酒精、二甲苯透明,采用中性树脂封片,并自然干燥后显微镜下观察。

1.5 分光光度法检测血清中TNF-α、IL-8表达水平 取上清液严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.6 ELISA法检测肺组织SOD活性及MDA、MMP-2、TIMP-1含量 应用匀浆机对肺组织进行匀浆后,加入组织裂解液裂解,取上清液严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.7 Western blot检测肺组织中蛋白表达 在冰上加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取肺组织蛋白,BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品与上样缓冲液混匀后煮沸,根据目的蛋白分子量制作浓缩胶和分离胶。加入样品后电泳,浓缩胶电压80 V,分离胶电压120 V,约2～3 h。取凝胶、滤纸、PVDF膜制作“三明治”进行转膜1 h。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h,稀释好的一抗溶液中4 ℃过夜;二抗溶液中37 ℃ 2 h。PVDF膜上滴加ECL曝光液,最后在凝胶成像系统中曝光。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理形态变化 正常组肺泡清晰、形态大小均较为完整;模型组肺泡增大、肺泡壁变薄、肺泡腔扩大,大量炎症细胞浸润;白藜芦醇组减少了炎症细胞浸润,并使肺泡结构变为正常完整。见图1。

A:正常组;B:模型组;C:白藜芦醇低剂量组;D:白藜芦醇中剂量组;E:白藜芦醇高剂量组图1 各组大鼠肺组织病理形态变化(HE染色,×200)

2.2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-8表达水平及肺组织MDA含量、SOD活性比较 模型组中TNF-α、IL-8、MDA含量较正常组升高,SOD活性较正常组降低(均P<0.01)。白藜芦醇低、中、高剂量组中TNF-α、IL-8、MDA含量较模型组降低,SOD活性较模型组升高(均P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-8表达水平及肺组织MDA含量、SOD活性比较

2.3 各组大鼠肺组织MMP-9及TIMP-1表达量比较 模型组中MMP-9表达量较正常组升高、TIMP-1表达量较正常组降低(均P<0.01);白藜芦醇低、中、高剂量组中MMP-9表达量较模型组降低,TIMP-1表达量较模型组升高(均P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1表达量比较(ng/mg)

2.4 各组鼠肺组织p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65表达量比较 模型组中p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65表达量较正常组上调(均P<0.01);白藜芦醇低、中、高剂量组中p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65表达较正常组下调(均P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠肺组织p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65表达量比较

3 讨 论

吸烟是COPD发病的独立危险因素,因此在烟熏诱导下能够构建稳定且与人类疾病相似的COPD模型[10-11]。本研究参考相关文献[7-9],通过烟熏联合脂多糖注射诱导法构建COPD大鼠模型,模型组大鼠肺部组织有明显的炎症细胞浸润,肺泡变大,肺泡腔扩大,肺泡壁变薄,说明COPD大鼠构建成功。白藜芦醇是一种广泛存在植物中的多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗凋亡、降低血脂及保护心血管等作用,且对COPD的治疗具有一定的效果[5-6]。因此本研究将进一步探讨白藜芦醇对COPD大鼠肺部组织损伤的影响及相关机制。

研究[12]认为COPD的发病机制涉及到炎性反应、氧化应激及蛋白酶系统的失衡。慢性炎症是COPD的主要特征,炎症因子TNF-α与IL-8共同参与了COPD的炎性反应,TNF-α是多种炎症因子的诱导剂,诱导中性粒细胞活化,加重炎性反应使气道结构重塑被破坏[12-13]。IL-8可进一步地促进淋巴细胞聚集及活化。本研究结果表明白藜芦醇能显著的降低COPD大鼠肺部组织中TNF-α与IL-8水平,进而减轻炎性反应。氧化应激是COPD的发病机制之一,长期暴露于有害颗粒环境下,COPD患者的抗氧化能力被减弱[14]。因此本研究接着探讨白藜芦醇对COPD大鼠肺部组织中MDA含量及SOD活性的影响,结果表明白藜芦醇能提高SOD活性,降低MDA含量,进而提高COPD大鼠的抗氧化能力。细胞外基质合成酶与降解酶的失衡是导致细胞外基质合成与降解失衡的重要原因,进而导致气道损伤及肺气肿[12]。TIMP-1作为MMP-9内源性抑制剂,通过抑制MMP-9活性而减少细胞外基质的破坏程度。所以本研究进一步探讨白藜芦醇对COPD大鼠肺部组织中MMP-9及TIMP-1含量的影响,结果表明白藜芦醇能显著的降低MMP-9表达,提高TIMP-1表达,进而减轻COPD大鼠肺气肿损伤。

p38 MAPK是MAPK家族的一员,能够通过将细胞质内的信号传递给细胞核,引起细胞核结构及功能发生变化。活性氧、细胞因子、紫外线照射、高渗等因素均能激活p38 MAPK信号通路,并调控下游转录因子进而参与多种病理生理过程[15]。NF-κB是p38 MAPK的下游信号分子,p38 MAPK是气道炎性反应的始动信号分子[16]。当NF-κB的核定位信号被暴露后,会使NF-κB磷酸化,加快核转入速度,介导炎症介质的产生及免疫细胞的增殖分化。有研究证实脂多糖能够激活中性粒细胞,进而使p38 MAPK磷酸化,进一步激活NF-κB,增加TNF-α表达,加重炎性反应[17-18]。而且p38 MAPK已成为COPD治疗新的分子靶点,其抑制剂在COPD临床治疗中效果显著[15,17],白藜芦醇对p38 MAPK具有显著调控作用[19-20]。因此本研究进一步探讨白藜芦醇对COPD大鼠肺部组织中p38 MAPK/NF-κB信号通路的影响,Western blot结果表明白藜芦醇能降低p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65磷酸化水平,进而抑制炎症因子释放,减少COPD大鼠肺部损伤。

综上所述,白藜芦醇能减少COPD大鼠肺组织炎症细胞浸润,减少TNF-α、IL-8分泌,提高SOD活性、TIMP-1表达量,降低MDA、MMP-9含量,其机制可能与阻断p38 MAPK/NF-κB信号通路有关。但本研究仅是实验观察结果,结果的进一步确认需要结合信号通路抑制剂的使用或者基因敲除技术的结合。