甲状腺相关眼病患者眼外肌中胶原蛋白和HSP47的表达△

王应璇 罗 鑫 罗泓杨 刘太祥

甲状腺相关眼病(TAO)是眼眶病中最常见的疾病之一,在成年人中的发病率约为20%。这种疾病不仅影响患者的外观容貌,而且由于突眼、复视、角膜暴露、视神经受压导致视力损害甚至失明,从而严重影响患者的工作和生活,给患者带来极大的痛苦[1-2]。目前TAO患者眼外肌肥大的原因仍然未知,胶原蛋白的代谢异常可能与此有关。热休克蛋白47(HSP47)是一种原胶原蛋白/胶原蛋白特异性分子伴侣蛋白,是合成、分泌成熟稳定胶原不可或缺的分子伴侣,它几乎可以在所有合成胶原的细胞中表达[3-5]。HSP47是调节组织中胶原含量变化的关键因素,其过表达导致了胶原异常累积使得组织纤维化。临床上,一些疾病导致器官纤维化的直接原因就是HSP47的异常表达[6-8]。我们课题组前期实验[9]已证明,TAO患者眼球球后脂肪组织中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原蛋白和HSP47的表达高于普通患者,纤维化程度也更高。因此,我们拟进一步探索Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原蛋白和HSP47在TAO 患者眼外肌中表达的特点,以及其是否在TAO患者眼外肌纤维化病理过程中发挥着作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象和标本采集

1.1.1 患者特征

2019年5月至2019年9月,遵义医科大学附属医院眼科与中山大学眼科中心合作,经过双方同意后收集当时就诊于中山大学眼科中心的静止期 TAO患者4例右眼眼外肌为TAO组(n=4),患者均明确诊断为 TAO 且服用过激素治疗,但不能改善患者眼部症状,需行眼眶减压手术解除眼部症状,缓解眼部不适,分别标记为A、B、C、D。由于伦理原因,正常人眼外肌组织无法获取。因此,同期选择在遵义医科大学附属医院眼科行斜视矫正手术的共同性外斜视患者4例右眼眼外肌为对照组(n=4),其中明确排除了TAO和Graves病,分别标记为a、b、c、d。

1.1.2 采集眼外肌组织

通过手术切除并收集患者眼外肌样本,用液氮快速冷冻后储存在-80 ℃的冰箱中。冷冻后的组织用于实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及Western blot检测。其余的组织被固定在40 g·L-1多聚甲醛中进行Masson染色和HE染色。

本研究流程符合《赫尔辛基宣言》原则,经遵义医科大学伦理委员会审核批准[伦理审查编号:(2018)1-143号]。所有患者均已签署知情同意书。

1.2 Masson染色观察两组眼外肌中胶原纤维及肌纤维

使用分级乙醇对两组眼外肌均进行脱水处理,然后将其嵌入石蜡中。石蜡凝固后,将标本按4 μm的厚度切片,并在干燥箱中干燥。石蜡切片脱蜡后用重铬酸钾、磺化铁、地衣红、磷钼酸和苯胺蓝染色。用冰醋酸和无水乙醇对染色的切片进行分化。最后,切片用无水乙醇和二甲苯处理,然后,用中性树胶密封对样品进行拍照并通过光镜进行分析。

1.3 HE染色观察两组眼外肌及细胞的形态

使用分级乙醇对两组眼外肌进行脱水处理,然后将其嵌入石蜡中。石蜡凝固后,将标本按4 μm的厚度切片,并在干燥箱中干燥。石蜡切片脱蜡后用苏木精染色细胞核、伊红染色细胞质。切片用无水乙醇和二甲苯处理,然后用中性胶密封对样品进行拍照并通过光镜进行分析。

1.4 Western blot检测两组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47表达

在清洗和机械切割眼外肌后,使用RIPA裂解缓冲液提取组织样品的总蛋白。在40 V的电压下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)4～5 h,当溴酚蓝用完时停止,将蛋白质转移到电泳槽中。与一抗在4 ℃下孵育过夜,然后清洗膜,用二抗在室温下孵育1.5 h。用化学发光法检测蛋白条带后,用ImageJ软件测量蛋白的灰度值,对蛋白条带进行灰度值分析,分别以GAPDH为内参,计算两组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的相对表达量。

1.5 qRT-PCR检测两组眼外肌中胶原蛋白 (Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ 型)和HSP47的mRNA 表达

利用Trizol试剂对两组眼外肌样本总RNA进行充分裂解,提出总RNA。经纯度鉴定和纯度测定后取出。两步法RT-PCR法反应合成cDNA(30 ℃ 10 min,42 ℃ 60 min,85 ℃ 10 min)。按说明书进行qPCR(20 μL体系:50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 32 s,共40个循环)。每个样本重复3次,采用 2-ΔΔCt法计算,取3次的平均值为两组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的mRNA相对表达量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 29.0软件对各组数据进行统计学分析。两组间比较采用独立样本t检验,数据以均数±标准差表示,采用Pearson相关分析两组眼外肌中HSP47与胶原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)的相关性。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 两组眼外肌中胶原纤维及肌纤维

经Masson染色的组织切片显示,TAO组与对照组中均显示大量胶原纤维,但对照组眼外肌形态模糊,胶原纤维分布较散乱;而TAO组眼外肌形态较清晰,胶原纤维排列较密集(图1)。

黑色箭头所指呈蓝色的纤维为胶原纤维,绿色箭头所指呈红色的纤维为肌纤维。图1 对照组 (A)与 TAO 组(B)眼外肌的Masson 染色结果(×400)

2.2 两组眼外肌及细胞的形态

HE染色结果显示,对照组眼外肌形态不清,肌细胞少见,排列紊乱无规则;TAO组眼外肌结构尚存在,形态较清晰,肌纤维数量高于对照组,分布较为集中,排列比较规则,横截面积大小不一(图2)。

黑色箭头所指呈红色且大小不一的椭圆形组织为眼外肌肌纤维的横截面。图2 对照组 (A)与TAO组 (B)眼外肌的HE染色结果(×100)

2.3 两组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47表达

Western blot检测结果显示,两组眼外肌均有胶原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47表达。但对照组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的相对表达量均高于 TAO 组(均为P<0.05)。进一步行Pearson相关分析发现,两组眼外肌中HSP47与胶原蛋白Ⅰ型(r=0.864,P<0.01)、胶原蛋白Ⅲ型(r=0.903,P<0.01)、胶原蛋白Ⅴ型(r=0.896,P<0.01)的蛋白表达均呈正相关(图3)。

注:与对照组比较,*P<0.05。图3 TAO组与对照组眼外肌中胶原蛋白和HSP47表达

2.4 两组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的mRNA表达

qRT-PCR检测结果显示,TAO组与对照组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的mRNA相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

表1 TAO组与对照组眼外肌中胶原蛋白和HSP47的mRNA相对表达量

3 讨论

TAO是一种常见的自身免疫性疾病。约85%的患者在其病程的18个月内就会出现眼部体征和症状[10]。TAO病变进程中,主要有眼眶成纤维细胞增生,细胞外基质堆积,脂肪细胞的分化、增生等导致了眶周组织水肿、眼外肌肥大、眼眶软组织容积扩大等[11-12]。眼眶成纤维细胞是TAO病理过程中的关键效应细胞[13-14],对炎症细胞因子异常敏感,其活化是导致TAO眼眶组织增生、纤维化的主要原因[15-18]。

纤维化的过程往往与细胞外基质异常堆积密切相关。减少细胞外基质的积累可能会缓解TAO患者的眼部不适感与临床症状,但细胞外基质异常积累的机制目前尚不清楚。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分,其代谢异常可能导致细胞外基质的积累,有学者已经在纤维化的肺组织中发现大量的胶原蛋白和细胞外基质沉积[19]。HSP47是特异性分子伴侣蛋白,不仅可以在所有合成胶原的细胞中表达,还具有独特的底物特异性,能识别内质网中胶原蛋白Gly-x-y序列中的Pro-Arg-Gly序列,尤其是精氨酸,它与新合成的前胶原结合,维持胶原蛋白三螺旋的稳定结构[20]。Naitoh等[21]报道,瘢痕组织中除了Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白mRNA较正常组织高20倍外,HSP47在mRNA和蛋白水平也分别高了8倍和16倍。细胞外胶原含量亦减少。本研究结果显示,两组眼外肌中不仅有Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原和HSP47的mRNA和蛋白表达,且HSP47的蛋白表达与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原的蛋白表达呈正相关。结合Masoon染色和HE染色结果,蛋白表达相对量较高的一组纤维化程度也较严重,提示了组织的纤维化程度与HSP47以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原的蛋白表达相一致。因此,我们推测TAO患者的眼外肌纤维化可能与HSP47的过表达及胶原的异常堆积有关。

已有大量相关文献报道,在光镜或是病理切片下观察到的正常眼外肌的肌纤维均匀分布,且大小、形态清晰正常,走行一致,排列整齐规则,间质成分较少,未见增生的纤维组织[22-24];而在部分共同性斜视眼外肌病理切片中则仅可见成熟的纤维胶原组织或结缔组织,未见或极少肌纤维可见,组织排列紊乱,胶原明显增多[25],本研究的Masoon染色和HE染色结果一致,对照组的眼外肌组织形态不清,肌细胞少见,排列紊乱无规则。而TAO组的结果则与胡依博等[26]研究结果相似:表现为眼外肌的肌腹肥大,肌纤维横断面肥大,大小不均匀,不规则样改变,而部分肌纤维边界不清。本研究中Masoon染色结果显示,两组眼外肌所表现出的纤维化程度差异同Western blot中所示HSP47以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原蛋白相对表达量的差异相对一致,即组织的纤维化程度同其内HSP47以及蛋白的相对表达量差异情况相一致,蛋白表达相对较高的一组纤维化程度也较严重。有报道称HSP47在压力性刺激下的表达会随着压力的增高而增加[27],而正是由于眶周组织的不断增生导致了TAO患者眶压增加。那么随着TAO病程的进展,HSP47是否会也随着眶压升高而表达增加目前仍需要进一步的研究。

对于本研究中出现qRT-PCR检测与Western blot以及Masoon染色结果不一致,我们推测这可能是由于以下原因所导致:(1)基因表达可分为转录和翻译两个水平,即mRNA水平和蛋白水平。(2)转录后存在加工,转录产物的降解、翻译、翻译后加工以及修饰好几个层面。所以转录水平和翻译水平并不完全一致,且这种调节在不同蛋白质之间存在差异。(3)mRNA与蛋白质的半衰期不同,mRNA极易降解,在组织内存在时间较短,而翻译成蛋白质后性质较稳定[28]。 除以上三点外还可能与患者在术前进行过激素处理有关,研究显示,在大剂量的甲基强的松龙的作用下,胶原及IL-1、IL-2、IL-4等炎症因子的表达会下降,而HSP47的mRNA 相对表达量也会随之下降[29-33],而HSP47表达下降可能进一步导致胶原蛋白的mRNA下降;但在短期内并未影响蛋白的表达。最终导致qRT-PCR实验结果与Western blot以及Masoon染色结果不一致。

4 结论

HSP47可在TAO患者眼外肌中表达;对照组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型)和HSP47的表达高于TAO组,纤维化程度也更高;两组眼外肌中的HSP47与两组眼外肌中胶原蛋白(Ⅰ、 Ⅲ、Ⅴ型)蛋白表达均呈正相关,所以眼外肌的纤维化可能与HSP47表达有关。但由于受伦理所限没有采用正常人眼外肌作为对照组,所以还需要进一步通过选择更佳的对照组进行全面的验证。