铁死亡在年龄相关性黄斑变性中的调控机制研究进展△

黄华发 刘东成 秦 波

近年来,铁死亡作为一种由脂质过氧化诱导发生的新型铁依赖性细胞程序性死亡[1],成为了热门研究领域,吸引了越来越多的学者投身其中。铁死亡在年龄相关性黄斑变性(AMD)的发生和进展中发挥重要作用。AMD是一种患病率和年龄呈正相关的疾病,其特征是视网膜铁积累和脂质过氧化,导致视网膜细胞损伤进而影响视力,造成视力下降、视物变形[2-3]。本文旨在探讨铁死亡在AMD的发生、发展中的作用,并探讨铁死亡抑制剂治疗该疾病的潜在可能性,为该疾病的治疗提供新的思路。

1 AMD概述

AMD是一种与年龄密切相关的黄斑退行性疾病[4]。黄斑是一个直径约5.5 mm的圆形区域。中央凹是黄斑上的小中央凹坑,由人眼中的锥体紧密排列组成,负责敏锐的中心视力[5]。随着年龄的增长,黄斑可能会发生变性,从而影响视力。

AMD的发病率在不同种族和地区之间存在差异。在种族方面,白种人患病率(5.4%)高于黑种人(2.4%)[6];在地区方面,欧洲患病率最高(12.33%),亚洲和非洲的患病率分别为7.38%和7.53%[5]。此外,中国不同地区的患病率也不同,人口密集的中南部地区患病率较高,而随着纬度的增加,患病率降低。AMD的影响主要集中在视网膜后部,其中包括视网膜色素上皮(RPE)、布鲁赫膜(BRM)和脉络膜的血管[4]。RPE细胞的作用是清除感光细胞产生的代谢废物,而黄斑区的高代谢活动会对RPE细胞的分解和清除能力提出更高的要求[3]。当衰老或坏死的RPE细胞无法满足分解和清除代谢废物要求时,就会破坏黄斑区外基质酶的平衡,导致代谢废物无法及时清除。未被清除的代谢废物会聚积在BRM上,形成玻璃膜疣,从而损害周边视网膜组织,导致RPE、BRM和脉络膜毛细血管出现萎缩,进而减少视网膜血液供应,最终逐渐影响黄斑区,缓慢发展成为干性AMD。此外,玻璃膜疣也会导致BRM的结构发生变化,如内胶原增厚和后弹力层断裂,这会使脉络膜毛细血管穿过BRM的裂隙进入RPE层,衰老的RPE细胞还会刺激血管内皮生长因子(VEGF)的增加,从而导致脉络膜新生血管(CVN)的形成[5];当CVN发生渗漏或出血时,就会形成湿性AMD。

AMD可划分为4个阶段[5]。第1阶段出现小的玻璃疣,但无色素异常,这是正常老化变化的一部分。第2阶段(早期AMD)玻璃疣会扩大到中等大小,但此时还未出现RPE细胞异常。第3阶段(中期AMD)会出现大的玻璃疣,并伴随着RPE细胞异常。通常,前三个阶段(早中期AMD)没有明显的临床表现。第4阶段,也称为晚期AMD,可分为干性AMD和湿性AMD。干性AMD占全球AMD病例的85%～90%[7],其特征是黄斑区玻璃膜疣[4]、色素紊乱和地图样萎缩,不涉及血液或血清渗出;湿性AMD占全球AMD病例的10%～15%[7],其特征是CNV及VEGF表达异常增加[8],涉及血液及血清渗出,在病程晚期,黄斑下出血机化,形成盘状瘢痕,中心视力完全丧失。AMD的发生与多种因素有关,其中,铁死亡与RPE细胞破坏及AMD的形成和发展有关。

2 铁死亡对AMD 的影响

2.1 铁死亡

2.1.1 铁死亡过程

铁死亡是一种调节性细胞死亡形式,主要由于脂质过氧化引起的。与其他类型的细胞死亡相比,铁死亡存在显著差异[9]。脂质过氧化反应是铁死亡的核心[1],其特征是脂质过氧化物不断积累[10]。铁水平在细胞内经历输入、输出和存储3个环节的调节,对应转运蛋白、铁输出蛋白(SLC40A1)和铁储存蛋白(Ft)[11]。在细胞外,Fe2+被亚铁氧化酶氧化成Fe3+后,会与铁转运蛋白(Tf)发生结合形成Tf-Fe3+复合物,然后通过Tf受体(TFR)内吞进入细胞内。Tf-Fe3+复合物随后解离,Fe3+在铁还原酶的作用下还原成Fe2+,并储存在细胞质中的Ft或线粒体铁储存蛋白(FtMt)中。当Ft被溶酶体降解后,释放出的Fe2+在细胞内被Fe2+伴侣蛋白识别并为Fe2+依赖性蛋白所利用。未被利用的Fe2+则作为活性氧化还原铁的来源进入不稳定铁池。未被储存或未被利用的Fe2+会通过SLC40A1所编码的铁泵蛋白排出细胞[2]。

随着细胞老化,Ft会被自噬降解,从而释放出 Fe2+。这些Fe2+会进入不稳定铁池进行积累,并和H2O2发生芬顿反应[12],从而产生活性氧(ROS)。ROS将会进一步与多不饱和脂肪酸反应,形成脂质过氧化物,导致铁死亡[2]。

2.1.2 铁死亡特征

铁死亡的形态学特征包括质膜完整性丧失、细胞质肿胀和细胞器肿胀,以及染色质浓缩。在超微结构水平,细胞铁死亡表现为线粒体萎缩、嵴减少或消失、膜密度增加[13]。在生化层面,铁死亡表现为谷胱甘肽(GSH)消耗增多,GSH过氧化物酶4(GPX4)活性降低以及无法催化脂质过氧化物还原反应代谢。从遗传角度看,铁死亡是多基因如P53、FSP1、核受体辅激活蛋白4(NCOA4)基因等共同调节的过程;铁死亡相关机制涉及多个途径,包括谷氨酸/胱氨酸逆向转运(Xc-)系统/GPX4途径、甲羟戊酸途径、硫转移途径、选择性自噬接头蛋白P62-kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)-核转录因子红系2相关因子2(NRF2)途径、自噬相关基因5-自噬相关基因7-NCOA4途径(铁蛋白自噬调节途径)、抑癌基因P53-亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1-花生四烯酸酯氧合酶15途径和抑癌基因P53/溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、热休克蛋白β-1-转铁蛋白受体1途径(热休克蛋白调节途径)、铁死亡调控蛋白1-辅酶Q10-还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸途径[14]。已有证据表明,在AMD的发生发展中,Xc-/GPX4途径、选择性自噬接头蛋白P62-Keap1-NRF2途径、抑癌基因P53/SLC7A11途径以及热休克蛋白β-1-转铁蛋白受体1途径均扮演重要的角色[13,15-17]。

2.2 铁死亡对AMD发生发展的调控机制

2.2.1 铁离子代谢途径

在RPE中,铁积累是过量自由基产生的一个来源,并且在干性AMD患者中,RPE中的铁积累随年龄增长而加速[18]。脂质运载蛋白2(LCN2)是脂肪因子蛋白家族的成员,在细胞内有2种存在形态,即单体或同源二聚体[19]。LCN2单体是一种铁螯合剂,对于维持细胞内铁稳态具有重要作用;而同源二聚体则无法螯合铁[20]。LCN2单体可以和自噬相关4B半胱氨酸肽酶、微管相关蛋白1的轻链3结合形成复合物,介导微管相关蛋白1的轻链3的脂化从而调节自噬体的合成[21]。自噬可以通过去除内源性炎症小体激活剂、去除炎症小体成分和细胞因子来负向调节炎症小体的激活[22]。LCN2同源二聚体在干性AMD患者和AMD样小鼠模型中扮演主导作用。由于LCN2同源二聚体无法形成复合物,会引起自噬体加工的改变和自噬通量的下降,从而导致细胞内铁稳态失调[21],同时LCN2同源二聚体还会增加干性AMD中的脂褐质生成和RPE损伤[23]。异常的铁积累会激活环状GMP-AMP合成酶-干扰素反应刺激因子cGAMP相互作用因子1途径[24],进而激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体,导致氧化应激和炎症性铁死亡。如果使用单克隆抗体靶向LCN2,就可增强自噬、减少脂质过氧化和铁死亡的变化,从而恢复视网膜功能[21]。

2.2.2 胱氨酸/谷氨酸逆向转运体途径

SLC7A11是细胞膜上的一种谷氨酸/胱氨酸转运蛋白,对胱氨酸和GSH的生物合成具有关键作用。它能够调节细胞内外GSH的数量和比例,从而保护细胞免受氧化应激和铁死亡[25]。实验证明,SLC7A11通路是铁死亡机制中最关键的上游因素之一[13]。正常情况下,SLC7A11将细胞内谷氨酸转运到细胞外,并将细胞外胱氨酸转运至细胞内。进入细胞内的胱氨酸行半胱氨酸合成,最终参与GSH的生物合成和ROS的解毒。然而,如果使用药物抑制SLC7A11介导的胱氨酸摄取,就会导致细胞内GSH的耗竭并诱导细胞的铁死亡[25]。相关研究发现,SLC7A11及其参与的铁死亡机制与激光诱导的CNV相关。SLC7A11能够保护RPE并减少CNV区域,当使用SLC7A11抑制剂柳氮磺胺吡啶抑制SLC7A11时,小鼠CNV区域面积会扩大,同时ARPE19细胞中GPX4表达下降,GSH水平降低,细胞最终发生铁死亡[16]。

2.2.3 脂质代谢途径

GPX4是铁死亡过程中重要的下游信号[13],可减少生物膜内脂质过氧化氢侵害[26]。GPX4的表达受GSH调控[13],使用GSH作为底物可将多不饱和脂肪酸脂质过氧化物(L-OOH)还原成脂质醇,从而保护RPE细胞免受脂质过氧化以减轻AMD小鼠模型中的视网膜变性[27]。除作为GPX4的重要底物,GSH在RPE细胞中也是直接的抗氧化剂。若去除ARPE-19细胞中的GSH,则GPX4表达会随之降低,致使L-OOH过度积累,引起铁死亡[9]。此外,GPX4的抑制剂RSL3也可诱导ARPE-19细胞发生铁死亡[18]。

2.2.4 核转录因子途径

在氧化应激状态下,NRF2作为抗氧化反应的关键调节因子,会激活多个靶基因应对氧化反应。其中,编码血红素加氧酶(HO-1)的HMOX1基因是NRF2下游靶点之一[28]。作为一种诱导性酶,HO-1被认为是氧化应激的可测量指标,在铁依赖性铁死亡中扮演重要角色。研究发现,在用碘酸钠处理的体内单层小鼠RPE细胞中,NRF2、SLC7A11和HO-1均有显著上调[17]。在未激活状态下,NRF2和Keap1重组蛋白会在细胞质中结合。但在氧化应激下,NRF2会易位到细胞核上,与SLC7A11相互作用,从而激活靶基因HMOX1并促进HO-1的转录生成[29]。HO-1上调会影响TFR和SLC40A1的表达水平,TFR上调会增加铁输入,而SLC40A1下调会使铁外流减少,最终引发细胞Fe2+过度积累,促进铁依赖性RPE铁死亡。细胞内Fe2+的积累反作用增加HO-1表达水平,形成恶性循环,加剧RPE细胞的铁死亡。倘若敲除HMOX1基因或使用HO-1抑制剂,就可破坏这种恶性循环,抑制RPE细胞铁死亡,从而最终预防光感受器的衰退并保护视觉功能,减缓干性AMD的发生和进展[30]。

2.2.5 自噬依赖性途径

自噬作为一种清理机制,通过靶向特异性自溶酶体介导和降解细胞质物质,以维持细胞内稳态。自噬可进一步分为巨自噬(简称自噬)、线粒体自噬、铁自噬等[31]。

光感受器被吞噬后的残留物积聚在RPE细胞中形成脂褐质[32],最终形成玻璃疣,对RPE细胞产生毒性作用。脂褐质成分N-亚视黄基-视黄基-乙醇胺可在早期诱导RPE细胞自噬[33]。RPE细胞自噬水平升高可减少脂褐质积累,延缓AMD进展,然而在AMD中,自噬表现出双重作用,轻度增加自噬可减轻RPE细胞退化,而过度自噬也可能导致视网膜细胞死亡[34]。

蔗糖铁是治疗缺铁性贫血的一种常用药物。研究发现,每周在小鼠尾部注射该药物1次,持续3周后,小鼠的感光器内段中会出现脂质过氧化产物丙二醇和4-羟基壬烯醛显著增加[35]。这2种脂质过氧化产物是自噬的强力诱导剂,能诱导RPE细胞过度自噬引起铁死亡[36]。此外,自噬、细胞凋亡及免疫调节相关基因Beclin-1是自噬的关键参与者,能够调节和诱导自噬。自噬体形成的核心调节因子BECN1可通过腺苷酸活化蛋白激酶直接与SLC7A11结合从而抑制Xc-系统的活性,促进GSH的消耗和脂质过氧化,从而导致GSH耗竭,介导铁死亡[37]。

在生理状态下,铁储存在含铁蛋白重链和轻链的铁蛋白复合物中。NCOA4与铁蛋白结合并促进铁蛋白向自噬体递送。当自噬体与溶酶体融合时,铁蛋白会被降解,导致铁释放,这个过程被称为铁蛋白自噬[38]。适度的铁自噬可以维持细胞内铁含量的稳定,但过度铁自噬会导致细胞内不稳定铁池中Fe2+水平升高,从而引发芬顿反应,导致细胞内ROS快速积累,最终引起铁依赖性铁死亡。敲低NCOA4的表达以及抑制铁自噬都能有效抑制铁死亡的发生[39]。

AMD的早期病理生理事件是自噬损伤和线粒体功能障碍[40]。随着年龄的增长,线粒体DNA(MtDNA)会出现不同程度的损伤,损伤的MtDNA累积会引起线粒体功能障碍,这或许与AMD的发病机制有关。线粒体自噬可以消除老化和受损的线粒体,减少损伤的MtDNA。FtMt的基因突变与AMD的发生有关。FtMt增加会通过RPE细胞中缺氧诱导因子1α调节途径触发线粒体自噬[23],对保护RPE细胞发挥重要作用。然而FtMt在AMD的发展中呈双相反应。玻璃膜疣积累会导致缺氧环境,从而降低FtMt水平,减弱其保护作用,诱发干性AMD。然而,增加FtMt会上调VEGF分泌,刺激CNV形成,形成湿性AMD[2]。

2.2.6 免疫相关途径

干性AMD的发展与免疫相关因子干扰素-γ(IFN-γ)密切相关。IFN-γ水平在干性AMD患者中明显升高,而向小鼠玻璃体腔注射IFN-γ可观察到白色玻璃膜疣样物质出现在小鼠眼底[11]。转铁蛋白SLC40A1负责将细胞内的Fe2+转运至细胞外[17]。IFN-γ抑制 SLC40A1表达,进而减少ARPE-19细胞内铁的外流,导致铁的积累[11]。同时,IFN-γ通过激活Janus激酶1/2(JAK1-2)/信号传导转录激活因子1(STAT1)/SLC7A11信号通路,抑制SLC7A11和溶质载体家族3成员2的表达,阻断谷氨酸/胱氨酸逆向转运系统Xc-,从而减少胱氨酸的摄取,抑制GSH的合成,导致GSH耗竭,促使RPE细胞发生铁死亡,从而加速AMD的发展[13,24]。JAK1/STAT通路位于IFN-γ受体的下游,因此JAK1-2/STAT1抑制剂可有效逆转IFN-γ诱导的GSH耗竭,减少铁死亡的发生[11]。

2.3 铁死亡抑制剂对视网膜的保护作用及治疗AMD的潜在应用

目前尚未有标准化治疗方案可用于治疗干性AMD,但一些干预措施,如保护神经、抑制炎症反应,可有效地降低干性AMD进展的风险[41]。研究发现,高剂量摄入维生素C、维生素E、β-胡萝卜素和锌等抗氧化剂也能降低干性AMD转化为湿性AMD的风险[42]。目前,常用治疗湿性AMD的方法是采用抗VEGF药物,如康柏西普、贝伐单抗和雷珠单抗等[5],但某些患者可能不会对该疗法产生反应,或者随着时间的推移和反复给药,抗VEGF药物的疗效可能会逐渐减弱[43]。因此,需要寻求新的治疗方法。铁死亡在AMD的发生和发展中起重要作用,这代表铁死亡抑制剂可能具有治疗AMD的潜在作用。以下是一些铁死亡抑制剂对视网膜保护作用的总结。

2.3.1 去铁胺及锌去铁胺

去铁胺(DFO)是一种由毛链霉菌自然分泌的铁螯合剂[2],在临床上主要用于治疗地中海贫血患者输血后出现的铁过载;未结合状态下的DFO结构类似松弛的面条,限制其穿过细胞膜进入细胞内[44],所以只能通过内吞作用积累在溶酶体中。研究证明,叔丁基过氧化氢可诱导RPE细胞发生脂质过氧化、GSH耗竭和Fe2+积累,从而导致RPE细胞发生铁死亡,而DFO可减弱叔丁基过氧化氢这种效应[18]。但DFO存在较大的眼部不良反应,包括白内障、视神经病变、视神经萎缩和视网膜异常[45]。锌去铁胺(Zn/DFO)是DFO的Zn复合物。与DFO不同的是,Zn/DFO呈球状结构,能够有效地渗透细胞膜。当Zn/DFO进入细胞内时,在存在Fe2+的情况下,DFO会先与Fe2+结合,形成较Zn/DFO更稳定的铁氧胺络合物。同时,Zn/DFO中的Zn2+分子也会与Fe2+竞争结合位点,从而通过2种途径控制Fe2+的量,减少芬顿反应所产生的ROS,保护RPE细胞,减缓AMD的进展[46]。此外,Zn/DFO并没有显著的视网膜毒性[42]。因此相对于DFO而言,Zn/DFO更有潜力成为AMD的新型治疗药物。

2.3.2 去铁酮

去铁酮(DFP)是一种可口服铁螯合剂,已在欧洲和亚洲获批使用,主要用于治疗地中海贫血综合征患者的铁过载[47],降低输血患者的铁水平。相对DFO,DFP分子量较低[2],可更容易穿过血脑屏障和血视网膜屏障[44],快速渗透至细胞和组织内,增强转铁蛋白的表达,去除可导致氧化损伤的游离铁,并且不会影响正常生理所需要的铁[48]。研究表明,把小鼠的铁调素基因敲除后,小鼠视网膜铁输出受损,会出现AMD特征的视网膜铁积累和变性[49]。给予小鼠口服DFP则可有效改善氧化应激,保护和防止视网膜变性[50-51]。目前尚未有证据表明长期使用DFP会对视网膜造成损伤。因此,DFP有望成为治疗铁过载引起视网膜变性的长期保护剂[51]。

2.3.3 地拉罗司

地拉罗司(DFX)是一种细胞渗透性铁螯合剂[44],也被美国食品和药品管理局批准用于临床治疗[48]。DFX可通过降低体内铁含量和氧化应激来保护视网膜神经元[44],但其保护作用较Zn/DFO弱。然而,DFX具有严重的不良反应,除了可能引起肝肾毒性[48],还可能导致中毒性黄斑病变,出现双眼无痛性视力丧失、中央暗点和视力障碍[52]。因此,关于DFX对视网膜的保护作用还有待研究。

2.3.4 其他铁死亡抑制剂

研究表明,GSH的消耗会导致ARPE-19细胞中GPX4表达下调,从而引起L-OOH积累,进而诱发铁死亡;使用铁死亡抑制剂铁抑素-1和脂血抑素-1可有效防止GSH缺乏引发的细胞死亡[9]。SLC7A11通过抑制RPE铁死亡和VEGF的产生来减少激光诱导的CNV,使用铁死亡诱导剂柳氮磺胺吡啶抑制SLC7A11则会促进VEGF的表达加剧CNV形成[16]。使用HO-1抑制剂可减少Fe2+的积累并抑制铁死亡,从而保护视觉功能以减少干性AMD的发生[17]。IFN-γ水平在干性AMD患者的RPE细胞中显著升高,升高的IFN-γ通过激活JAK1-2/STAT1/SLC7A11信号通路促进铁死亡,使用JAK1-2/STAT1抑制剂可有效减少铁死亡发生[11],从而减缓干性AMD的发展。

3 结束语

胱氨酸/谷氨酸逆向转运体途径和脂质代谢途径是铁死亡途径的典型代表,在干性和湿性AMD的发生发展中发挥重要作用。铁离子代谢途径、核转录因子途径、自噬依赖性途径和免疫相关途径等途径主要通过铁过载引起铁死亡,对干性AMD产生主要影响。但这些机制之间也存在相互作用,铁离子代谢途径异常会导致铁的积累,从而刺激生成炎性小体,引发炎症性铁死亡,同时也会生成ROS,影响Xc-/GPX4途径,导致铁过载性铁死亡;铁过载还可以刺激核转录因子途径,增加HO-1表达,从而形成恶性循环。因此,调控AMD的铁死亡机制涉及多种因素和途径。

目前有些研究结果存在争议。研究表明,自噬减弱会导致AMD中脂褐质的生成和RPE损伤增加[23]。干性AMD患者RPE细胞自噬能力的下降会激活炎性小体,引起炎症性铁死亡,加速衰老的进展,使得AMD进一步发展[21]。但也有研究发现,自噬过强也有可能引起代谢应激、降解细胞成分,引起铁过载性铁死亡[36]。自噬表现出双重作用,但目前尚无法确定何种程度的自噬为减弱或过强,以及干性AMD到底是自噬减弱还是自噬增强导致的。这些问题仍需进一步研究。

目前,湿性AMD主要采用抗VEGF治疗方案;但干性AMD尚无标准化的治疗方案,因此未来的研究可能会集中于干性AMD的治疗。干性AMD的发生和发展与多种机制引起的铁死亡有关;线粒体自噬表现出对干性AMD的治疗潜力[23],而靶向LCN2、HO-1、IFN-γ等因素也有望被开发为干性AMD的治疗策略[11,17,21]。玻璃膜疣是AMD最早的临床特征,玻璃膜疣积累引起RPE、BRM结构性的变化导致晚期AMD,即干性和湿性AMD,因此在AMD的早期阶段通过调节自噬进行治疗,有望减缓疾病的进展,这亦是一种对于早期AMD的治疗思路[34]。然而关于抑制铁死亡在AMD的治疗效应仍缺乏相关临床研究,这仍然是一个待解决的问题。未来随着对铁死亡和AMD的研究深入,相信将有更多新的治疗药物被研发出来,为临床医师提供更多治疗选择,为AMD患者提供更加有效的治疗方法,减轻AMD对人类视力健康的威胁。