巨噬细胞代谢重编程在新生血管性年龄相关性黄斑变性中的作用研究进展△

李桐栖 孔德平 孙晓东

脉络膜新生血管(CNV)是新生血管性年龄相关性黄斑变性(NVAMD)的典型病理特征[1],目前50%～60%的NVAMD患者对抗血管内皮生长因子(VEGF)的一线治疗方案反应不完全,存在持续性疾病活动[2-4],仍需寻找新的治疗靶点。巨噬细胞是组织稳态修复与重塑的关键免疫细胞,在调节病理性血管新生过程中至关重要[5-6],在NVAMD患者的病灶上可观测到巨噬细胞的显著浸润[7],然而研究发现,抑制巨噬细胞的募集[8-9]或玻璃体内注射巨噬细胞[10]均可显著抑制CNV病灶,因此,需要进一步明确巨噬细胞的致病机制。

巨噬细胞是高可塑性细胞,在响应局部微环境的刺激中,获得不同功能表型,包括由脂多糖(LPS)激活的经典激活状态(M1) 和由白细胞介素(IL)-4等激活的替代激活状态 (M2)[11]。M2巨噬细胞被认为是促脉络膜新生血管形成的主要功能表型,敲除IL-10[12]或抑制ROCK通路[13]进而抑制M2极化可显著抑制CNV。然而,释放炎性因子的M1巨噬细胞也被认为存在促血管作用[14],在NVAMD患者的眼中,房水中的炎性因子水平与CNV病灶的大小及活动程度相关[15],炎性巨噬细胞可通过δ样蛋白4通路诱导血管芽的形成[16],表达IL-1、IL-6的炎性巨噬细胞对CNV形成至关重要[17-18]。迄今为止,驱动血管生成的巨噬细胞的确切表型及形成机制仍不明确。新近研究表明,代谢重编程是巨噬细胞效应功能调节的关键因素[19-20],因此,深入了解巨噬细胞促血管新生表型的代谢变化及形成机制,有望进一步明确其致病作用,为NVAMD治疗提供新靶点。

1 巨噬细胞的代谢重编程

巨噬细胞的代谢重编程,即巨噬细胞代谢改变与其免疫功能调节的关系,是免疫领域新近关注的重要方向。巨噬细胞具有显著的代谢灵活性,在其活化启动及效应过程中,巨噬细胞改变其原有的代谢途径,其胞内代谢物组成显著改变。近年代谢研究技术的进步,使得细胞内代谢物得以量化,并得以进一步绘制细胞中激活的代谢途径,极大地加深了我们对巨噬细胞重编程的理解。过去认为,细胞代谢仅作用于能量调节,而越来越多的证据显示,代谢调节是巨噬细胞重编程功能表型的关键因素[19-20]。

1.1 关键代谢酶与代谢物调节巨噬细胞效应功能及活化表型

在巨噬细胞的效应过程中,关键代谢酶的调节可以影响细胞功能。例如,在LPS诱导的巨噬细胞中,关键代谢酶M2型丙酮酸激酶(PKM)2不仅参与糖酵解调节,还与缺氧诱导因子1α(HIF1α)相互作用促进炎性因子IL-1β的转录[21-22]。许多糖酵解酶都被证明与巨噬细胞的促炎功能有关,己糖激酶1参与炎性小体激活[23],而甘油醛-3-磷酸脱氢酶控制着重要细胞因子α肿瘤坏死因子的转录后表达[24-25]。除了调控关键细胞因子的表达和效应通路之外,调节代谢酶还可以直接改变巨噬细胞极化状态,如研究发现,诱导PKM2进入四聚体状态,可使巨噬细胞的基因表达从M1表型重编程为M2表型[26]。

代谢物的改变是另一调节巨噬细胞的重要途径。代谢物通常通过与代谢酶活性位点的竞争性和变构结合,调节酶的活性以调节代谢途径[27]。新近研究发现,代谢物与蛋白质(如受体)的结合会诱导特定的细胞反应,从而激活特定的信号通路。例如,琥珀酸受体(GPR)91是琥珀酸的细胞表面传感器,可增强IL-1β的产生[28]; GPR132可以感知乳酸并对其做出反应,促进小鼠巨噬细胞中M2表型的产生[29-30]。除了直接作用外,代谢物还可以作为翻译后修饰的底物,通过调节组蛋白或功能蛋白改变下游基因的转录或关键通路。作为调节巨噬细胞功能的重要代谢物,来自糖酵解的代谢物如乳酸,来自三羧酸(TCA)循环的代谢物如乙酰辅酶A、琥珀酸、衣康酸,及脂质和氨基酸代谢过程中衍生的棕榈酸、谷氨酸近年来受到广泛的关注[31]。

1.2 巨噬细胞活化表型的形成依赖特异代谢途径

不同功能表型的巨噬细胞激活不同的关键代谢途径。例如,在暴露于促炎刺激物(例如 LPS)后,炎性巨噬细胞葡萄糖摄取大量增加,糖酵解活性显著升高,而TCA循环存在两处特异性中断,导致氧化磷酸化活性受到抑制。与之不同的是,IL-4活化的M2巨噬细胞保持完整的TCA循环,除了氧化磷酸化及脂肪酸代谢通路高度上调外,M2极化激活特异性的谷氨酰胺分解和核苷酸糖合成代谢模块[32]。

更重要的是,进一步研究发现,改变代谢途径对巨噬细胞表型调节存在特异性。例如,在M2激活中,使用N-糖基化抑制剂显著抑制其特异标志蛋白白细胞分化抗原(CD)206、CD301的表达,但仅轻微影响M1蛋白标志及M1特异细胞因子的表达;同样,剥夺谷氨酰胺对M2极化有着显著影响,其特异CC类趋化因子(CCL)22分泌蛋白水平显著下调,但不改变M1标志物一氧化氮合酶(NOS)2的表达。因此,代谢途径在不同巨噬细胞活化表型的形成中起着直接、特异和关键的作用。

2 促血管新生型巨噬细胞的代谢调节

巨噬细胞在血管新生的不同过程中都起着重要调节作用,包括早期发芽、吻合及晚期新血管的稳定。在血管新生早期,暴露于促血管生成信号的内皮细胞经历迁移和增殖,从预先存在的血管中形成新芽。巨噬细胞是促血管生成信号的重要来源,包括VEGF-A、TGF-β、CCL18、轴突导向蛋白(Sema)4D等多种因子[33]。除旁分泌作用外,巨噬细胞可通过直接接触刺激介导血管芽的生长,并充当尖端细胞形成吻合的细胞伴侣,有助于血管芽的融合链接[34]。最后,巨噬细胞对周细胞的调控可以增强新血管的稳定性。

代谢重编程是巨噬细胞表型形成的关键,但尚不明确代谢如何调节促血管生成型巨噬细胞。新的证据指出,糖酵解是促血管生成型巨噬细胞活化的关键[35],在病理性血管新生病灶附近的巨噬细胞糖酵解活性升高,产生大量乙酰辅酶A,导致组蛋白乙酰化和诱导促血管形成基因表达,从而将巨噬细胞重编程为血管生成表型;与此一致的是,糖酵解代谢途径可导致巨噬细胞分泌乳酸增加,乳酸是血管发芽公认的主要驱动代谢物[30]。然而,Willenborg等[14]提出糖酵解特征不足以支持有效的促血管生成反应,促血管生成型巨噬细胞需要利用线粒体呼吸;敲除电子传递链DARS酶后,线粒体呼吸功能异常导致线粒体介导的HIF1α稳定性降低,最终抑制了巨噬细胞促炎和促血管新生的表型。

此外,脂质代谢也是巨噬细胞促血管生成表型调节的关键途径。临床上,多项研究提示了脂质及其代谢物是新生血管性眼病的有效调节剂,包括ω-3 和 ω-6等长链不饱和脂肪酸,改变巨噬细胞脂质合成和输入的平衡,显著调节其功能[36]。CD36介导的脂质摄取增加可导致炎症反应增加[37],脂肪酸的过度摄入与积累可诱导巨噬细胞的IL-1α释放以驱动血管炎症[38],而增加脂肪酸氧化、减少脂质积累,可以抑制炎性细胞因子的产生[39]。巨噬细胞的功能也与脂质池的组成有关,不同的TLR信号和细胞因子可诱导巨噬细胞获得特异的脂质组[40]。目前对促血管生成型巨噬细胞的脂质池组成尚不明确,如何改变巨噬细胞的脂质组成与摄取平衡以抑制血管新生尚需进一步探索。

3 NVAMD中促巨噬细胞代谢重编程的调节因素

在CNV的发生发展过程中,组织微环境的不同细胞进行动态交流,氧气和营养物质的可用性在血管形成过程中不断变化,巨噬细胞的代谢始终处于动态的变化过程中,受到微环境及全身因素的复杂调控,包括组织缺氧、细胞互作、衰老、肥胖等重要因素的影响。微环境中的各种刺激可以改变巨噬细胞的代谢,从而调节塑造促血管生成型巨噬细胞的功能表型。

3.1 组织缺氧

组织缺氧是巨噬细胞的强激活剂[41],在NVAMD患者的病灶中,一方面,在病灶处,由于脉络膜毛细血管缺失、眼部血流量减少和玻璃膜疣沉积,脉络膜向视网膜侧的氧气供给可能受到抑制,造成局部缺氧[42];另一方面,在血管形成中,浸润的免疫细胞和非免疫细胞局部增加可上调局部耗氧量。除了增加糖酵解代谢外,缺氧还会抑制巨噬细胞的线粒体呼吸和氧化磷酸化活性,巨噬细胞中存在缺氧敏感的受体如COMM结构域(COMMD)1,介导整合下游炎症信号转导与代谢途径[43]。事实上,缺氧巨噬细胞的条件培养基比暴露于常氧的巨噬细胞的条件培养基具有更高的血管生成能力[30],组织缺氧可能是调节巨噬细胞代谢、促进CNV发展的关键因素。

3.2 细胞相互作用

巨噬细胞还面临着与组织微环境中其他细胞的营养竞争及相互代谢调节。在CNV中,内皮细胞与巨噬细胞毗邻,内皮细胞所分泌的代谢物可显著调节巨噬-内皮的细胞间交流。既往报道,在肌肉再生期间,糖酵解活性增强的内皮细胞可释放乳酸促进邻近巨噬细胞的M2表型[30],而在病理性血管生成的微环境中,进一步地证实了内皮细胞可通过乳酸促进巨噬细胞糖酵解,诱导巨噬细胞促炎促血管新生相关基因的表达[35]。此外,在小鼠激光诱导的CNV模型中发现,急性激光损伤导致的坏死视网膜色素上皮细胞也可能是上调巨噬细胞糖酵解的促进因素[44]。在AMD的发展中,病变的内皮细胞及视网膜色素上皮细胞可能是维持巨噬细胞促血管新生表型的关键。

3.3 全身因素

免疫细胞受到全身因素的调节,其中,衰老是NVAMD最显著的危险因素。随着年龄的增长,巨噬细胞的功能与代谢调节也发生变化,相对于年轻的巨噬细胞,老年巨噬细胞葡萄糖通量和线粒体呼吸减弱,同时,衰老的巨噬细胞失去使用替代燃料来源的能力,加剧了这一能量缺乏的状态[45]。衰老也同时改变细胞的营养感知,引起多条代谢途径的改变,尤其是线粒体功能和相关的氧化应激,巨噬细胞平衡这些状态的能力下降,可导致衰老过程中的促炎激活[46]。

作为构成先天免疫系统的重要组成部分,NVAMD患者的巨噬细胞受到既往免疫事件的刺激影响,从而调节其重编程。Hata等[47]指出,既往的肥胖病史所导致的异常血液代谢物硬脂酸,可以重塑巨噬细胞染色质景观,诱导巨噬细胞的表观遗传重编程,促进CNV形成。因此,全身因素,如衰老、肥胖,可能对诱导巨噬细胞开启促炎及促血管生成表型起到重要作用。

4 巨噬细胞代谢重编程在NVAMD中的作用机制

巨噬细胞代谢重编程的过程,伴随着糖酵解、TCA循环、氧化磷酸化、脂肪酸和氨基酸代谢等多条途径的协同改变,但对调控巨噬细胞促NVAMD发展的关键代谢途径及其作用机制尚处于探索之中。

新近研究发现,糖酵解是巨噬细胞调节NVAMD的重要代谢途径,其一,对人类NVAMD患者的血液和小鼠CNV形成过程中的骨髓、血清及脉络膜进行检测,均发现乳酸水平的升高[48]。乳酸是糖酵解的终产物,乳酸水平的上调提示NVAMD中巨噬细胞存在糖酵解活性上调。其二,通过特异性敲除髓系细胞的糖酵解关键酶PFKFB3,发现CNV的形成显著被抑制[44],这可能与巨噬细胞糖酵解激活后增强的下游HIF和核因子-κB信号转导通路有关[44]。其三,巨噬细胞糖酵解增强导致的乙酰辅酶A累积,也可以介导组蛋白乙酰化及其调控的促炎促血管新生的基因表达增加[35]。

此外,脂质代谢调控也是巨噬细胞调节CNV的重要途径。研究表明,NVAMD患者巨噬细胞的ATP结合盒转运蛋白1(ABCA1)表达减少,从而导致胆固醇流出的抑制,其胞内游离胆固醇水平升高可显著改变表型,促进M2标志物如IL-10、CD163的表达,上调其促内皮细胞增殖的能力[49]。同时,脂肪酸调节对CNV形成也有显著影响,而抑制多不饱和脂肪酸代谢途径的细胞色素 P450 氧化酶,可显著抑制CNV的形成[50]。

尽管目前的研究证实了糖脂代谢在巨噬细胞调节NVAMD中的重要作用,但对其整体的代谢改变影响尚不明确。一方面,对NVAMD中巨噬细胞线粒体、氨基酸等重要代谢途径的调节作用知之甚少;另一方面,胞内代谢途径之间可受到中间代谢产物的改变相互影响,因此,尚不明确代谢途径之间如何平衡调节。另外,巨噬细胞受到复杂的组织微环境及全身因素的调节,其代谢物的可用性、关键代谢酶的调节也随之发生改变,这使得代谢途径的改变更为复杂,还需综合考虑多因素调节,以明确巨噬细胞形成功能表型过程中的关键代谢酶及关键代谢物。

5 结束语

对于理解巨噬细胞促血管生成表型形成及效应功能,代谢重编程提供了新的视角,引起了领域内的广泛关注,但年龄相关性黄斑变性中巨噬细胞免疫代谢相关的许多问题尚未得到解答。一方面,单细胞转录组测序数据揭示了小鼠和人类眼部巨噬细胞群的复杂性[51-52],需要新的方法来评估巨噬细胞不同亚群、不同阶段的代谢通量,然而,许多代谢物的寿命非常短暂,这使得分离保留病变巨噬细胞具有挑战性,空间分辨代谢组学[53]和单细胞代谢组学[54]技术的兴起可能会有所助益。另一方面,代谢途径相互作用复杂,不同的代谢途径由于共享燃料的输入与合成而相互影响,精确的代谢流标记可能有助于阐释代谢途径间的补偿机制,进而明确代谢途径的特异作用,有助于治疗靶点的筛选。在肿瘤、心血管疾病中,代谢途径已成为新近免疫治疗药物研究的热门靶点[55],因此,阐明巨噬细胞在NVAMD中的代谢重编程机制,有利于进一步开发新靶点,满足当前临床的治疗需求。