基于转录组测序的楚雄腮扁叶蜂飞行肌蛋白及飞行能量代谢相关酶挖掘

俞 虹 ,高 波,徐 进*,刘建宏,李永和*

(1. 西南林业大学云南生物多样性研究院,昆明 650224;2. 西南林业大学云南省高原湿地保护修复与生态服务重点实验室,昆明 650224;3. 四川轻化工大学生物工程学院,四川自贡 643000)

昆虫飞行是一个复杂的机械和生化过程,其微观机制和分子基础有待进一步阐明(Vigoreaux, 2006; Glaeseretal., 2017)。昆虫飞行由胸腔中发达的飞行肌驱动(Vigoreaux, 2006)。飞行肌由特化的肌原纤维(Myofibril)组成(Tiegs, 1955)。肌原纤维又由粗肌丝和细肌丝组成,粗肌丝主要由肌球蛋白(Myosin)组成,它与细肌丝的肌动蛋白(Actin)相互作用,完成肌丝的滑动过程。在飞行肌中还发现了其他保守的肌原纤维蛋白,如原肌球蛋白、肌钙蛋白和肌联蛋白等。随着研究的深入,不断又有新的昆虫飞行肌特异性蛋白被发现,例如飞行蛋白Flihgtin、肌钙蛋白-H和谷胱甘肽S-转移酶(Maughan and Vigoreaux, 1999)。Flightin可以与肌球蛋白结合,维持肌节的完整性和稳定性(Ayer and Vigoreaux, 2003)。谷胱甘肽S-转移酶可与细肌丝中的肌钙蛋白-H相互作用,并在昆虫飞行过程中起到至关重要的作用(Claytonetal., 1998)。通过全基因组RNAi筛选,还在果蝇中发现Spalt major(Salm)是飞行肌发育的重要调控因子(Schönbaueretal., 2011)。昆虫飞行肌发育是很多蛋白质参与的调节和组装过程,其调控机制仍有待进一步深入阐明(Vigoreaux, 2006; Glaeseretal., 2017)。

昆虫飞行是一个极其耗能的过程,需要非常高的能量代谢及供给效率(Beenakkersetal., 1984)。昆虫可以以碳水化合物(主要是海藻糖)、脂肪(主要是二酰基甘油)和脯氨酸为能源物质来为飞行提供能量(Thompson and Suarez, 2009)。在一些长距离迁飞性昆虫中,例如一些蛾类和蝗虫,飞行最初以碳水化合物为燃料,而长距离飞行可能激活脂肪酸氧化途径进行供能(Arrese and Soulages, 2010)。蜜蜂主要使用碳水化合物来为飞行提供能量(Thompson and Suarez, 2009),而一些甲虫则以脯氨酸作为主要飞行能源物质(Gade and Auerswald, 2002)。相应地,一些飞行能量代谢关键酶也得到了鉴定,例如催化海藻糖转化为葡萄糖的海藻糖酶、催化3-磷酸甘油醛生成丙酮酸的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Thompson and Suarez, 2009; Arrese and Soulages, 2010)。然而,由于飞行相关研究较少,我们对昆虫飞行和相关能量代谢机制的了解仍然有限。

近年来一些基于深度测序和生物信息学的相关研究进一步为该领域提供了更深入的见解。例如沙蟋Gryllusfirmus飞行肌转录组分析发现了翅型特异性基因表达(Vellichirammaletal., 2014)。

楚雄腮扁叶蜂CephalciachuxiongicaXiao是近年来云南省除松毛虫以外新发生的重大松科植物食叶害虫,主要危害云南松Pinusyunnanensis和华山松Pinusarmandii(萧刚柔, 2002; 李永和, 2010)。在云南,云南松和华山松种植面积最大,为楚雄腮扁叶蜂的大发生提供了较好的条件。此外,该害虫危害多发生在海拔高、土壤贫瘠的松林内,严重破坏本已十分脆弱的生态环境。本研究拟在上述基础之上,首先通过电镜观测对楚雄腮扁叶蜂飞行肌显微结构有一个初步认识,再通过飞行肌转录组测序和生物信息学分析,挖掘楚雄腮扁叶蜂飞行肌结构蛋白及飞行能量代谢相关酶基因,并在此基础上构建飞行能量代谢途径。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

楚雄腮扁叶蜂成虫采自云南省寻甸县受害云南松林内。该虫的化蛹和羽化发生在地下,因此直接用上午从土壤中挖出新羽化的成虫用于实验(Yanetal., 2018)。为了减小实验误差,本研究均选择雌虫(较雄虫大,易于取样)用于实验。

1.2 飞行肌电镜观测

取3头新挖出(0日龄)的雌成虫通过生理解剖获得飞行肌组织用于电镜观测,每头雌虫为 1个重复,因此共有3个重复。

飞行肌样品通过3.5%戊二醛溶液前固定,1%锇酸后固定,酒精、丙酮逐级梯度脱水,环氧树脂618渗透、包埋,半薄切片,光镜定位,修切,LEICA-R型超薄切片机切片,柠檬酸铅-醋酸铀双染色后,用JEM-1011透射电镜进行观察。

1.3 飞行肌转录组测序及分析

1.3.1cDNA文库的构建和测序

取45头0日龄雌虫的飞行肌组织,每15头雌虫的飞行肌组织合并为一个重复用于转录组测序,因此共有3个转录组样品。

采用Trizol reagent (Invitrogen, USA)从3个组织样品中提取总RNA。利用带有Oligo(dT)的磁珠从总RNA中分离出mRNA。采用RNA Fragmentation Reagents (ABI, USA)将mRNA随机打断,通过磁珠筛选分离出300 bp左右的小片段。在逆转录酶的作用下,加入六碱基随机引物(Random hexamers),以这些片段为模板反转合成一链cDNA,随后进行二链合成,形成稳定的双链结构。采用NEBnext Ultra RNA Library Prep Kit (NEB, USA)制备测序cDNA文库。采用AMPure XP system (Beckman Coulter, USA)纯化系统获得150～200 bp的cDNA文库片段。最后采用Illumina Hiseq4000平台对合格的文库进行测序。

1.3.2测序数据的组装、质控及基因功能注释

对获得的Raw Reads进行过滤处理,获得能够用于后续数据分析的Clean Reads。使用Trinity 2.5.1对获得的Clean Reads进行组装,获得转录本数据。然后,使用TGICL 2.1对Trinity转录本进行聚类,获得无冗余的unigenes数据。

使用ExPASy-Translate tool确定每个单基因的ORF。通过对NCBI NR数据库进行BLASTX比对,以阈值E <1e-5,完成单基因功能注释。

1.3.3飞行肌结构蛋白及飞行能量代谢相关酶挖掘及生信分析

基于基因功能注释及文献报道,从楚雄腮扁叶蜂飞行肌转录组测序数据中筛选飞行肌结构蛋白。基于前人报道的昆虫能源物质利用类型和推导的主要反应步骤,通过对昆虫及其他物种相关研究文献检索以及生化和生物信息学比较分析,从楚雄腮扁叶蜂飞行肌转录组测序数据中筛选飞行能量代谢三条途径可能涉及的关键酶。

所选蛋白序列的系统发育分析通过MEGA 7.0软件采用最大似然法(ML)基于Poisson correction模型构建,Bootstrap重复次数为1 000次。飞行蛋白Flightin模体结构(Motif)分析采用MEME软件进行。采用NCBI结构域数据库预测蛋白质保守结构域。采用Swiss model和UCSF ChimeraX 1.13进行蛋白质三维结构分析。

1.3.4基于关键酶的飞行能量代谢途径构建

将上述筛选到的飞行能量代谢关键酶构建到前人报道的基于代谢底物及产物的代谢途径基础骨架上(Thompson and Suarez, 2009),获得较为完整(有代谢物及反应关键酶)的飞行能量代谢途径。

2 结果与分析

2.1 飞行肌显微结构

电镜观测表明,肌原纤维是组成飞行肌的基本成分(图1)。肌原纤维横切面为椭圆形,其间每条粗丝被六根细丝包围,这些细丝以六边形等距排列,粗丝与细丝数量的比例为1∶3,一般粗丝有1 000根,细丝有3 000根(图1-a～c)。粗丝和细丝都附着在称为Z线或Z盘的结构上,该结构垂直于纤维的长轴,从一个Z线到另一个Z线为一个肌节长度(图1-d～f)。肌节的中间有一条窄带,称为M带,M带两边与Z线之间的区域称为A带(图1-f)。线粒体呈不规则形状。在线粒体和肌原纤维之间,有水平或垂直排列的气管。肌原纤维被线粒体和气管包围。显微测量表明,肌原纤维横切面平均面积为0.771 ± 0.042 μm2,肌节平均长度为2.698 ± 0.116 μm。

图1 楚雄腮扁叶蜂飞行肌显微结构

2.2 飞行肌转录组测序和组装

通过转录组测序并对原始数据进行过滤处理,样品的平均clean reads数约为52 000 000个,单个read平均长度为148 bp。各样品clean reads的Q20和Q30值分别为98.58%～98.67%和95.37%～95.63%,表明本研究RNA测序质量较好。

2.3 飞行肌结构蛋白筛查

基于基因功能注释及文献报道,从楚雄腮扁叶蜂飞行肌转录组测序所获得的unigenes中共筛选到11大类飞行肌结构蛋白(表1),其中肌球蛋白(Myosin)和肌动蛋白(Actin)的unigenes数较多,分别为127个和54个。

表1 楚雄腮扁叶蜂飞行肌结构蛋白编码基因

2.4 飞行蛋白fightin序列及系统发育分析

最新研究表明飞行蛋白Fightin具有较高的保守性,但其功能可能存在多样性,值得进一步研究。楚雄腮扁叶蜂Flightin mRNA可编码一个长152 aa的蛋白质。基于Flightin蛋白序列的系统发育分析表明,膜翅目昆虫以自展支持率99%形成一个单系分支,表明该系统发育树与传统分类学吻合(图2)。

图2 基于Flightin蛋白序列构建的系统发育树

在Flightin序列中没有发现保守的结构域,因此进一步对其模体结构(Motif;是指序列中局部的保守区域)进行了分析。共检测到6个Motifs(图3),其中Motif 1、2和5在所有物种中存在。Motif 1多序列比对发现,多数氨基酸呈现较高的保守性(图4)。在膜翅目昆虫中,一些位置上的氨基酸表现出明显的特异性(图4)。

图4 飞行蛋白Flightin同源序列Motif 1的多序列比对

2.5 飞行能量代谢相关酶筛查

基于已知昆虫能源物质利用类型及主要代谢步骤,对昆虫及其他物种相关生化和生物信息学研究结果进行比较分析,初步确定了昆虫飞行能量代谢三条途径可能涉及的27个关键酶(表2)。进一步基于本研究转录组测序及基因功能注释,在楚雄腮扁叶蜂中找到了25个关键酶的同源序列(表2),未找到的两个酶为α-1,6-葡萄糖苷酶和甘油二酯脂肪酶。这些关键酶一般都有多个同源异构体(不同基因编码)或剪接异构体(同一基因通过可变剪接获得)。

表2 昆虫飞行能量代谢关键酶和代谢物(全称、缩写及功能)

2.6 飞行能量代谢关键酶序列及系统发育分析

首先选取糖原磷酸化酶(GP)及脯氨酸脱氢酶(PRODH)进行了系统发育分析。结果显示,来自不同物种的同源序列聚集在一起,所得到的系统发育树与传统分类学结果完全一致(图5)。

图5 基于糖原磷酸化酶(GP)及脯氨酸脱氢酶(PRODH)蛋白序列构建的系统发育树

通过文献查阅及比对,发现黑腹果蝇DrosophilamelanogasterGPDH可分为细胞质GPDH和线粒体GPDH两大类(图6)。细胞质GPDH有3个编码基因,所得异构体分别为X1、X2和X3型,每一型经可变剪接又可得到多个剪接异构体;线粒体特异性GPDH有1个编码基因,可产生1～2个剪接异构体。基因筛查表明楚雄腮扁叶蜂及其他膜翅目昆虫中可能只有1个细胞质GPDH(可形成多个剪接异构体)和1个线粒体GPDH(可产生1～2个剪接异构体)编码基因(图6)。前人在黑腹果蝇中的研究表明GPDH-X1有3个剪接异构体(图7),其中X1-1可能为飞行肌特异GPDH,其C端的特异三联肽(QNL)可能与GPDH定位到肌原纤维上有关。然而本研究在楚雄腮扁叶蜂及其他膜翅目昆虫的GPDH中并未发现类似C端三联肽(图7)。黑腹果蝇和楚雄腮扁叶蜂的GPDH-X1均含有1个glycerol 3P_DH结构域(图7-a～b),并具有相似的蛋白质三维结构(图7-c～d)。

图6 双翅目和膜翅目3-磷酸甘油脱氢酶X1 (GPDH-X1) C末端序列比较

图7 3-磷酸甘油脱氢酶X1 (GPDH-X1)结构域及蛋白质三维结构

2.7 基于关键酶的飞行能量代谢途径构建

基于上述筛选到的关键酶构建了楚雄腮扁叶蜂飞行能量代谢的三条途径(图8)。第一条是糖酵解途径,其初始能源物是飞行肌中的糖原和脂肪体中的海藻糖,其反应涉及15种酶,所产生的乙酰辅酶A进入三羧酸循环最终产生能量。第二条是脂肪氧化途径,其初始能源物是来自脂肪体的甘油二酯,涉及6种酶,所得到的乙酰辅酶A进入三羧酸循环产生能量。第三条是脯氨酸氧化途径,其初始能源物是来自脂肪体的脯氨酸,涉及4种酶,所得到的α-酮戊二酸进入三羧酸循环产生能量。

图8 飞行能量代谢途径和关键酶

3 结论与讨论

楚雄腮扁叶蜂飞行肌主要由肌原纤维、线粒体和微气管系统组成(图1)。昆虫飞行肌肌原纤维与节肢动物和脊椎动物的常见骨骼肌纤维相比,其长度更长并较易解离(Tiegs, 1955)。每个肌原纤维由约1 000根粗丝和3 000根细丝组成,组装成称为肌节的结构(图1)。粗丝主要由运动分子肌球蛋白组成,肌球蛋白与细丝的肌动蛋白相互作用,在肌丝的滑动过程中起作用(Vigoreaux, 2006)。丰富的气管系统和巨大的线粒体是昆虫飞行肌的两个最突出的特征,这些结构在生理上可以很好地适应昆虫飞行的特殊要求(Vigoreaux, 2006)。每个线粒体都与末端气管接触或被末端气管包围,增加了飞行肌的呼吸效率(Wigglesworth and Lee, 1982)。

通过飞行肌转录组分析,从所获得的unigenes中共筛选到11大类飞行肌结构蛋白(表2),其中肌球蛋白的unigenes数最多,达到了127个。肌球蛋白占肌原纤维总蛋白质含量的60%,是一类可沿着肌动蛋白丝轨道运动的分子马达超大家族,在肌肉收缩方面发挥作用(Ojima, 2019)。本研究也找到了一个楚雄腮扁叶蜂飞行蛋白Flightin。在果蝇中,Flightin是间接飞行肌中一种多磷酸化的肌原纤维蛋白(Vigoreauxetal., 1993),对粗肌丝的长度和稳定性有重要影响,也是飞行肌收缩、拉伸、增强延迟力的关键决定因素(Reedyetal., 2000; Contompasisetal., 2010)。Flightin同源物不仅在有翅昆虫目中发现,而且还在虱目和缨尾目等无翅目昆虫目中发现(Giribetetal., 2001; Xueetal., 2013; Soto-Adamesetal., 2014)。有趣的是,该蛋白在非昆虫的六足动物中也有发现,例如弹尾目和双足目,甚至在一些甲壳类中也有发现,如背甲目和双甲目(Soto-Adamesetal., 2014)。因此,飞行蛋白可能是一种具有丰富进化血统的蛋白质,并且在飞行肌之外发挥作用(Soto-Adamesetal., 2014)。在褐飞虱Nilaparvatalugens中,Flightin不仅在飞行肌中表达,而且在雄虫的两个腹未体节的背纵肌(DLM)中表达,还可能在DLM驱动褐飞虱雄性特异性鼓膜结构振动中起到重要作用(Chenetal., 2019)。

基于生物信息学和文献检索,在楚雄腮扁叶蜂中找到了25种飞行能量代谢关键酶(表1)。基于这些酶在楚雄腮扁叶蜂中构建了三条可能的飞行能量代谢途径(图8)。楚雄腮扁叶蜂属膜翅目(萧刚柔, 2002)。在大多数膜翅目和双翅目昆虫中,碳水化合物构成飞行的主要能源物质(Martin and Lieb, 1979; Beenakkersetal., 1984)。近年研究发现,一些膜翅目的蜜蜂和黄蜂也可以使用脯氨酸作为飞行能源物质(Teulieretal., 2016)。然而,膜翅目昆虫是否以及在多大程度上使用脂肪来为飞行提供能量仍然不清楚,值得进一步研究。

飞行中的昆虫达到了已知的所有动物最高代谢率,但他们如何做到这一点仍然知之甚少(Glaeseretal., 2017)。生化研究表明,昆虫飞行肌中与能量代谢有关的大多数酶的活性远高于脊椎动物骨骼肌(Crabtree and Newsholme, 1972; Crabtree and Newsholme, 1975)。昆虫飞行能量代谢酶对肌原纤维具有高亲和力,并多以复合物的形式存在,有助于局部生成ATP(Wojtasetal., 1997; Sullivanetal., 2003)。这些显著的生理生化特征确保昆虫能够以高频率和高超的技巧进行飞行。截至目前,在作用机制方面研究较为深入的是果蝇GPDH。果蝇肌原纤维M-线中GPDH的浓度相对高于Z-线,而GPDH与后者的结合比前者更稳定(Sullivanetal., 2003)。果蝇GPDH X1型存在3种剪接异构体(图7),其中GPDH-X1-1可能是飞行肌特异性异构体,其特有的C端的三联肽(QNL)可能与GPDH定位到肌原纤维上有关(Sullivanetal., 2003)。本研究中,我们确实在楚雄腮扁叶蜂和其他膜翅目昆虫中发现了多个GPDH同源异构体(图6),但并没有发现类似果蝇的这种C端特异三联肽。数据库比对搜索也没能在果蝇以外的昆虫物中发现类似的C端三肽,表明GPDH的进化可能存在物种特异性。