舞毒蛾谷胱甘肽S-转移酶对杨树次生物质协同溴氰虫酰胺的胁迫响应

范程程,李明俊,许力山,齐 琪,孙丽丽,曹传旺*

(1. 东北林业大学森林生态系统可持续经营教育部重点实验室,哈尔滨 15004;2. 内蒙古赤峰市宁城县坤头河林场,宁城 024228)

昆虫谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)在异源化合物的解毒中起重要作用,并与杀虫剂抗性有关(Huangetal., 2011)。GSTs主要催化亲电化合物与还原性谷胱甘肽(GSH)的巯基结合,对底物进行亲核代谢,使合成产物更易溶于水和排泄(Habigetal., 1974)。植物通过产生对昆虫有害或有毒的次生物质来抵御植食性昆虫,同时对昆虫体内的解毒酶具有诱导作用(Howe and Herde, 2015),昆虫为了降低植物次生物质带来的不利影响,也进化出多种适应性机制,例如体内作用靶标发生变化,各种代谢酶诱导表达等(陈澄宇等, 2015)。绿盲蝽Apolyguslucorum、斜纹夜蛾Spodopteralitura、麦红吸浆虫Sitodiplosismosellena等昆虫取食不同的植物次生物质后,能够诱导GST基因表达上调(黄敏燕等, 2018;朱香镇等, 2018;陈锐等, 2020)。

溴氰虫酰胺(Cyantraniliprole)是新型邻二苯甲酰胺类杀虫剂,具有高效低毒、杀虫范围广、安全、不易产生交互抗性等特性(胡译文等, 2016;李增鑫, 2021)。亚致死剂量溴氰虫酰胺处理甜菜夜蛾Spodopteraexigua、灰飞虱Laodelphaxstriatellus、小地老虎Agrotisypsilon,昆虫体内GST活力表现为明显的诱导作用,表明GST参与昆虫解毒并起到关键作用(余慧灵, 2018;何发林等, 2019;张凯伦等, 2020)。

昆虫响应次生物质与化学杀虫剂的共胁迫毒理研究已有相关报道。董向丽等(1998)研究表明芸香苷与甲基对硫磷联合处理可以大幅度提高棉铃虫HelicoverpaarmigeraGST的活性。芸香苷、槲皮素和2-十三烷酮可诱导棉铃虫体内GST活性升高,槲皮素处理组对甲基对硫磷的敏感性降低近50%,芸香苷和2-十三烷酮处理组对甲基对硫磷的敏感性略有降低(高希武, 1997)。植物化感物质可以诱导棉铃虫体内GST活性,可以利用其寄主的植物化感物质来阐述其对灭多威和毒死蜱的防御(Zhuetal., 2017)。韭菜迟眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga在大蒜和腐殖质饲养的幼虫GST活性高于在韭菜和平菇上饲养的幼虫,所以在大蒜和腐殖质上饲养的幼虫抗胁迫能力增强(Chenetal., 2018)。目前,国内外对于杨树次生物质参与舞毒蛾响应杀虫剂代谢机制研究甚少,因此,本文通过在饲料中分别添加寄主杨树次生物质(黄酮、槲皮素、芦丁)以及溴氰虫酰胺,测定舞毒蛾幼虫存活率、GST活性及其基因的表达量,从基因和蛋白水平评价杨树次生物质对舞毒蛾响应溴氰虫酰胺敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

舞毒蛾卵块采集于内蒙古自治区赤峰市宁城县坤头河林场,人工饲料购买于中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所。将舞毒蛾卵块包裹于纱布中后浸泡于10%～15%甲醛溶液40 min,自来水冲洗10 min并晾干水分,幼虫孵化后置于人工气候箱内(25℃、光周期14 L∶10 D、相对湿度70%)进行饲养,挑取健康、大小一致的舞毒蛾2龄幼虫作为供试昆虫。

1.2 主要试剂

谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性检测试剂盒购自Solarbio公司。SYBR Green Real-time PCR Master mix荧光定量PCR试剂盒购自Toyobo公司;RNeasy Mini购自Qiagen公司;Taq聚合酶及PCR相关试剂、Prime ScriptTMRT reagent Kit cDNA合成试剂盒均购自TaKaRa公司。黄酮(Flavone)原药(99.0%)购自Amresco公司,槲皮素(Quercetin)原药(97.0%)购自Scientific Instrument公司,芦丁(Rutin)原药(95.0%)购自上海九鼎化学科技有限公司,溴氰虫酰胺原药(97.0%)购自DuPont公司。

1.3 舞毒蛾致毒处理

黄酮、槲皮素和芦丁含量的选择参考杨树叶片次生物质含量及相关胁迫浓度,3种次生物质的含量分别为黄酮0.8%(w/w)、槲皮素0.02%(w/w)和芦丁0.5%(w/w)。根据毒力测定结果(表1),将溴氰虫酰胺处理舞毒蛾2龄幼虫48 h亚致死浓度LC30(4.06 mg/L)作为处理浓度。黄酮(8.8 g/L)、槲皮素(0.22 g/L)、芦丁(5.5 g/L)经换算后分别与溴氰虫酰胺(4.06 mg/L)混合作为联合处理1、联合处理2和联合处理3。将不同药剂溶于二甲基亚砜(DMSO)后混入人工饲料作为处理组,对照组为加入等量DMSO的人工饲料。

表1 溴氰虫酰胺对舞毒蛾2龄幼虫48 h毒力

选择健康、活泼、大小一致舞毒蛾2龄幼虫饥饿24 h后,分别接入含溶剂DMSO、黄酮、槲皮素、芦丁、溴氰虫酰胺、联合处理1、联合处理2、联合处理3的饲料中,每个处理20头幼虫,重复4次,处理后于6 h、12 h、24 h、48 h随机挑取活泼的舞毒蛾2龄幼虫,经液氮速冻后保存于-80℃冰箱,用于后续检测GST活性及其基因表达量。

1.4 舞毒蛾GST活性测定

谷胱甘肽S-转移酶(GST)测定按照GST活性检测试剂盒(Solarbio)说明书的步骤进行,活性单位为μmol/min/mg protein。蛋白质含量测定采用Bradford(1976)的考马斯亮蓝G-250法。

1.5 实时荧光定量RT-PCR

采用RNeasy Mini动物组织总RNA提取试剂盒提取对照和不同处理的舞毒蛾样品总RNA。采用Prime ScriptTMRT reagent Kit cDNA合成试剂盒将各处理组0.5 μg Total RNA分别合成cDNA,作为实时荧光定量RT-PCR模板。选择课题组前期从舞毒蛾转录组中筛选获得的经次生物质处理后可引起基因诱导表达上调的GST基因(LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1)作为候选基因(王振越, 2020),检测GST基因表达量。

实时荧光定量RT-PCR使用SYBR Green Real-time PCR Master mix试剂盒,内参为Actin和EF1α基因,引物序列见表2。实时荧光定量RT-PCR反应体系为2×SYBR premix Ex Taq酶10 μL、Primer mix (10 μmol/L) 1 μL、cDNA 2 μL,使用DEPC水补足至20 μL。反应条件为:94℃预变性30 s,94℃变性12 s,60℃退火45 s,72℃延伸45 s,81℃读板1 s,45个循环,每个样品重复3次。

表2 目的基因RT-qPCR引物序列

1.6 数据统计与分析

实验结果以平均值±标准差表示,运用SPSS 17.0软件,采用Duncan方法进行差异显著性分析(P<0.05),用GraphPad Prism 8.0.2软件进行绘图。实时荧光定量RT-PCR数据经仪器自带的Opticon Monitor 3软件处理。舞毒蛾GST基因表达量用2-△△Ct方法进行相对表达量分析(Pfaffl, 2001)。

Abott公式用于评估联合药剂对受试对象的联合毒性(Gisi, 1996;Gatidou and Thomaidis, 2007),期望抑制率Cexp及复合胁迫表征值RI分别用下式表示:

Cexp= A+B-AB /100%;RI=OI / Cexp

式中A、B分别表示单一组分胁迫抑制率;OI为联合胁迫抑制率;RI用于判断两种组分对受试对象的联合毒性;RI<1表现为毒性拮抗,RI=1表现为毒性简单相加,RI>1表现为毒性协同(Chesworthetal., 2004)。

2 结果与分析

2.1 次生物质与溴氰虫酰胺联合作用对舞毒蛾存活率的影响

舞毒蛾2龄幼虫在不同胁迫处理下48 h存活率不同(表3)。处理48 h后,对照组(DMSO)、槲皮素、芦丁处理组幼虫存活率为100%,黄酮处理组存活率为93.33%。溴氰虫酰胺处理组幼虫存活率为66.67%,显著低于对照(DMSO)和次生物质单剂处理组(P<0.05)。在48 h,3个联合处理组幼虫存活率与溴氰虫酰胺处理组差异不显著。存活率依次为53.33%、60.00%和53.33%。联合处理1、联合处理2和联合处理3联合胁迫表征值分别为1.24、1.20和1.40,联合毒性均表现为协同作用。

表3 次生物质和溴氰虫酰胺对舞毒蛾幼虫存活率的影响

2.2 次生物质与溴氰虫酰胺联合作用对GST活性的影响

除了6 h之外,不同植物次生物质单独处理后的酶活性均有诱导增加作用。与黄酮和芦丁处理组相比,槲皮素处理组在24 h和48 h对GST酶的诱导作用更强,分别为2.65 μmol/min/mg protein和2.43 μmol/min/mg protein。溴氰虫酰胺对GST活性诱导效果显著高于单一次生物质作用,24 h诱导效果最大,为2.79 μmol/min/mg protein,为对照组的2.36倍。除联合处理1在6 h、12 h的GST诱导活性分别低于溴氰虫酰胺处理6 h、12 h活性外,各联合处理组的GST诱导活性均高于溴氰虫酰胺处理组。联合处理2在24 h和48 h诱导活性分别为3.65 μmol/min/mg protein和 3.24 μmol/min/mg protein,分别为对照组的3.09倍和3.12倍,显著高于联合处理组1和联合处理3。溴氰虫酰胺和联合处理胁迫对GST的诱导趋势均表现为先升高后降低,且在24 h达到峰值(图1)。

图1 次生物质和溴氰虫酰胺对舞毒蛾2龄幼虫GST活性影响

2.3 次生物质与溴氰虫酰胺联合作用对GST基因表达的影响

不同胁迫处理对舞毒蛾2龄幼虫GST基因LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1表达的影响如图2所示。不同胁迫处理均使LdGSTe2基因表达水平上调。芦丁处理6～24 h,LdGSTe2表达量显著高于其它次生物质处理组,且在6 h基因表达量上升至最大值,是对照组的24.08倍。3组联合处理6 hLdGSTe2基因表达水平均显著高于对照组,分别为对照组的3.15倍、37.98倍和6.48倍,高于溴氰虫酰胺单剂的基因表达量,其中联合处理2的诱导作用显著高于其它处理组。

图2 次生物质和溴氰虫酰胺对舞毒蛾幼虫GST基因表达量影响

图2 次生物质和溴氰虫酰胺对舞毒蛾幼虫GST基因表达量影响

次生物质和溴氰虫酰胺胁迫均使LdGSTs1基因表达水平显著上调。黄酮组处理48 h后,LdGSTs1基因表达量显著高于槲皮素处理组和芦丁组的基因表达量,为对照的10.88倍。溴氰虫酰胺处理组LdGSTs1表达量为对照组基因表达量的1.02～3.71倍,且除6 h和24 h外,溴氰虫酰胺在12 h和48 h基因表达量显著低于芦丁和槲皮素处理组基因表达量。3种联合处理6 h、12 h和48 hLdGSTs1表达水平显著上调,联合处理1处理48 hLdGSTs1基因表达水平显著升高,为对照组基因表达量的11.21倍。联合处理2处理12 h,LdGSTs1表达量为对照组的5.22倍。联合处理3处理6 h,LdGSTs1表达量上升至最大值,为对照组基因表达量的10.88倍。

黄酮处理48 hLdGSTs2基因表达量显著升高,为对照组基因表达量的33.02倍,但在其它时间点LdGSTs2的相对表达量则较对照组显著降低。槲皮素处理24 h,LdGSTs2的表达水平显著降低,为对照的27.09%。溴氰虫酰胺处理6 h,LdGSTs2的相对表达量显著高于对照,为对照的24.06倍,同时6～24 h的基因相对表达量均高于次生物质处理组。3种联合处理6 h,LdGSTs2相对表达量显著上调,联合处理3的基因表达量最大,为对照的33.02倍,但12～48 h联合处理1和联合处理2LdGSTs2相对表达量低于对照组。

次生物质胁迫下LdGSTz1相对表达量上调,其中槲皮素处理组LdGSTz1基因表达量高于其它次生物质处理组,且在48 h基因相对表达量达到最高值,为对照的11.20倍。溴氰虫酰胺处理24 h后,LdGSTz1的基因表达量为对照的2.96倍,但在12 h 和48 h的基因表达量均低于次生物质处理组。3种联合处理组LdGSTz1基因表达量显著高于对照组。联合处理1处理12 h基因表达量达到峰值,为对照的3.77倍,但在12～48 h的基因表达水平逐渐降低。联合处理2在12 h的基因表达量最低,为对照的1.62倍,但随时间延长基因表达逐渐升高。联合处理3组的基因表达水平表现为先升高后降低。在6～24 h的基因表达量由对照的1.64倍上升至对照的4.44倍,但在48 h降低至对照的1.83倍。

3 结论与讨论

研究发现谷胱甘肽S-转移酶活性的升高可以加快对外源有毒物质的代谢过程,增强昆虫对逆境的适应性(李时荣等, 2018;樊艳平等, 2020)。氯氟氰菊酯、氟虫腈和硫丹3种杀虫剂处理马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata后,LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTo5和LdGSTt1均显著过量表达(Hanetal., 2016)。甲氧虫酰肼处理棉铃虫48 h后GSTs1相对表达量显著升高,而GSTe2表达量先降低后升高,表明GSTs1和GSTe2通过表达量的变化影响GST酶活力进而形成对杀虫剂的抗性(徐希宝等, 2014);水杨酸和芦丁饲喂舞毒蛾后,可使LdGSTe4和LdGSTo1显著诱导表达,将该基因沉默后会导致幼虫对水杨酸和芦丁的适应性降低(Maetal., 2021)。舞毒蛾LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因在对次生物质的胁迫响应中表达量显著升高,将舞毒蛾相关GST基因沉默后,导致幼虫对不良环境的适应能力减弱,证实昆虫对不良环境的应答机制与GST基因的表达密切相关(王振越,2020)。次生物质和溴氰虫酰胺对舞毒蛾GST主要表现为显著诱导效应,其中联合处理胁迫下的GST酶活性主要表现为高于溴氰虫酰胺处理,但与各联合处理所对应的次生物质单剂相比显著上升,且呈现不同的时间-活力趋势变化。

害虫取食不同寄主植物后,对杀虫剂的敏感性可分为3类:敏感性下降、无明显变化以及升高(姚洪渭等, 2002)。本研究综合评价3种杨树次生物质黄酮、槲皮素、芦丁影响舞毒蛾对溴氰虫酰胺敏感性,次生物质与溴氰虫酰胺联合毒性效果均为协同作用。舞毒蛾在次生物质的诱导下,GST解毒活性升高,基因表达水平增加,证明GST相关基因参与了舞毒蛾对植物次生物质的解毒代谢过程(Maetal., 2021),舞毒蛾抗药性增强,敏感性下降,受到化学药剂胁迫后,舞毒蛾死亡率上升,这是因为寄主植物中的次生物质诱导激活或抑制昆虫体内与杀虫剂代谢相关的解毒酶系,导致昆虫对药剂敏感性发生变化(Nenaetal., 2018)。次生物质饲喂水稻、小麦、狗尾巴草诱导的中华稻蝗Oxyachinensis体内GST活性的变化是导致其对马拉硫磷敏感性差异的原因之一(张睿, 2008)。饲喂芸香苷后,提高了棉铃虫对甲基对硫磷和灭多威的耐药性,棉铃虫取食槲皮素提高了其F2代对灭多威的毒力;取食2-十三烷酮后,提高了棉铃虫对溴氰菊酯的耐药性(董向丽等, 1998)。斜纹夜蛾幼虫饲喂大豆和菜花后对丙烯磷有较高的GST诱导活性(Karuppaiahetal., 2016)。因此,在制定舞毒蛾的防治策略时,应考虑不同寄主植物对舞毒蛾解毒酶的诱导和毒性改变的重要性,这为植物与昆虫互作提供更加丰富的理论依据,并指导生产实践中杀虫剂的合理使用。