基于网络药理学和分子对接技术探讨防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的作用机制*

姜健,严军

上海市嘉定区中医医院,上海 201800

防己黄芪汤出自张仲景的《金匮要略》,为固表益气、祛风利湿的经典良方。全方由防己、黄芪、白术、甘草组成,防己和黄芪为君药,具有益气固表、祛风行水之效;臣药为白术,佐以健脾补气祛湿,助君药之效;甘草为佐使药,以助君臣,兼以调和诸药[1]。防己黄芪汤在现代临床运用中较为广泛,涉及肥胖、糖尿病等代谢性疾病及肾脏疾病、心肺疾病、肢体关节痛、风湿性疾病、癌病等[2-3]。在中华医学会内分泌学分会等撰写的2021年《基于临床的肥胖症多学科诊疗共识》中指出,中医辨证论治是治疗肥胖症的有效手段之一,推荐防己黄芪汤治疗脾虚不运型肥胖[4]。一项随机对照的临床研究表明,防己黄芪汤可有效改善单纯性肥胖患者的肥胖指标和血脂水平,提高临床疗效[5]。本文利用网络药理学和分子对接技术方法探讨防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的作用机制,为后续深入进行机制研究提供基础。

1 资料与方法

1.1 防己黄芪汤有效活性成分的筛选及靶点预测运用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)获取防己黄芪汤组方中药的化学成分,设定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18,获得防己黄芪汤的有效活性成分。同时通过TCMSP平台预测有效药物活性成分的作用靶点。最后利用 Uniprot 数据库对靶点蛋白名称进行标准化处理。

1.2 单纯性肥胖的疾病靶点获取通过查询 GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和 在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/),以“simple obesity”为关键词进行筛选,将两个数据库查询的疾病靶点进行合并,删除重复项,获取单纯性肥胖的疾病靶点。其中,GeneCards数据库获得的疾病靶点选取相关度评分(relevance score)≥3的靶点。

1.3 防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点通过Omicshare平台(https://www.omicshare.com/)将单纯性肥胖疾病靶点与防己黄芪汤有效成分相关作用靶点取交集,绘制药物作用靶点与疾病靶点韦恩图,交集靶点即为防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点。

1.4 “中药-活性成分-潜在靶点”网络构建和关键有效活性成分筛选将筛选获得的防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的交集靶点和其对应的活性成分、中药导入Cytoscape 3.9.1软件,构建“中药-活性成分-潜在靶点”网络图,并运用Analyze Network进行网络拓扑分析,依据Degree值大小决定节点大小,节点越大,该节点越关键,并依此筛选出关键药物活性成分[6]。

1.5 蛋白质互作网络(protein-protein interaction networks,PPI)构建及核心靶点筛选将防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的作用靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/),蛋白物种设置为“Homo sapiens”,最低相互作用阈值设为medium confidence>0.4,隐藏蛋白互作网络中孤立靶点,其他参数保持默认设置,获得蛋白互作网络分析结果,并以TSV格式导出。运用Cytoscape 3.9.1软件将蛋白互作网络进行可视化,利用“Cytohubba”插件进行拓扑分析,按照Degree大小排序,将Degree排名前8位的靶点进行聚类展示,并以此作为核心靶点[7]。

1.6 防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点的富集分析应用R软件中Bioconductor模块软件包“org.Hs.eg.db”运行完entrez ID转换;采用R软件中的“DOSE”“clusterProfiler”等模块对筛选出防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析,以P<0.05为筛选参数,输出富集分析结果,然后使用ImageGP平台(http://www.ehbio.com/ImageGP/)将GO和 KEGG分析的结果进行可视化调整,制成对应的气泡图。

1.7 防己黄芪汤关键药物活性成分与核心靶点的分子对接在Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载防己黄芪汤的关键活性成分和靶点的3D结构;利用PYMOL 2.5.0软件对核心靶点蛋白进行去除水分子、去除配体等操作,并采用 AutoDock Tools 软件进行加氢、平衡电荷等修饰,最后将受体蛋白和配体小分子分别转化为pdbqt格式。利用 AutoDockVina软件对受体蛋白与配体小分子进行分子对接,获得关键化合物与核心靶点分子对接结合能参数,最后运用PYMOL 2.5.0软件对分子对接结果进行可视化。

2 结果

2.1 防己黄芪汤有效活性成分及靶点通过TCMSP平台获得防己黄芪汤各组方中药的有效活性成分及作用靶点,然后利用 Uniprot 数据库对相关靶点蛋白名称进行标准化处理,最终获得黄芪的有效活性成分16个,相应靶点99个;防己有效活性成分2个,相应靶点18个;白术有效活性成分3个,相应靶点11个;甘草有效活性成分88个,相应靶点107个,见表1。将所有中药的有效活性成分以及靶点整合,删除重复项,获得防己黄芪汤有效活性成分101个,相应靶点110个。

表1 防己黄芪汤部分药物活性成分

2.2 防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点整合GeneCards和OMIM数据库获得单纯性肥胖的疾病靶点总数为1 195个。将单纯性肥胖的疾病靶点与防己黄芪汤有效活性药物成分的110个作用靶点取交集,获得61个治疗靶点,即是防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点,见图1。

图1 单纯性肥胖疾病靶点与防己黄芪汤有效活性成分靶点VEEN图

2.3 “中药-活性成分-潜在靶点”网络图和关键有效药物成分筛选结果将防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点和其对应的活性成分、中药导入 Cytoscape 3.9.1软件进行可视化,构成“中药-活性成分-潜在靶点”网络图,见图2。运用Analyze Network进行网络拓扑分析,获得159个节点,708个边,按照Degree的大小排序,排名前4位的化合物为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花黄素,即为防己黄芪汤的关键药物活性成分,后续与核心靶点进行分子对接。

图2 “中药-活性成分-潜在靶点”网络图

2.4 PPI网络拓扑分析及核心靶点的筛选结果防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的61个作用靶点导入STRING数据库,然后获得PPI网络分析结果,以TSV格式导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化,形成涉及60个靶点,578对蛋白互作关系的网络图。利用“Cytohubba”插件筛选出 PPI网络图中Degree值前8位的蛋白靶点进行聚类,并以此作为核心靶点,即是白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,CASP3)、雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ESR1)、MYC、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)。见图3。

图3 防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在靶点PPI网络图

2.5 防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在作用靶点的富集分析结果GO富集分析选取生物学过程(biological process,BP)、细胞成分(cellular component,CC) 和 分子功能(molecular function,MF) 中可信度前20位的条目进行注释,见图4。在BP中,潜在作用靶点主要富集在类固醇激素反应(response to steroid hormone)、对酮的反应(response to ketone)、活性氧代谢过程(reactive oxygen species metabolism process)、类固醇激素刺激的细胞反应(cellular response to steroid hormone stimulus)、缺氧反应(response to hypoxia)等;在CC中,靶点蛋白集中在薄膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、囊泡腔(vesicle lumen)、线粒体外膜(mitochondrial outer membrane)、血浆脂蛋白颗粒(plasma lipoprotein particle)、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物(RNA polymerase Ⅱ transcription factor complexe)等;而MF分析显示,潜在作用靶点主要富集在核受体活性(nuclear receptor activity),转录因子活性、直接配体调节序列特异性DNA结合(transcription factor activity,direct ligand regulated sequence-specific DNA binding),类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity),DNA结合转录激活剂活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性(DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase Ⅱ-specific),氧化还原酶活性、作用于NAD(P)H、血红素蛋白作为受体(oxidoreductase activity,acting on NAD (P) H,heme protein as receptor),半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process),氧化还原酶活性、作用于配对供体、结合或还原分子氧(oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen),泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding),ATP酶结合(ATPase binding),激活转录因子结合(activating transcription factor binding)等。

注:图中的点越大,说明富集的基因越多,圆点颜色越红,说明富集的可信度越大。图4 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析的结果选取可信度排名前30位的通路,见图5。靶点基因主要富集的信号通路为胰岛素抵抗(insulin resistance)、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease)、脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等,同时还涉及卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、丙型肝炎(hepatitis C)、爱泼斯坦-巴尔病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、乙型肝炎(hepatitis B)等病毒感染相关通路,以及结直肠癌(colorectal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、乳腺癌(breast cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)等癌症相关通路。

注:图中圆点越大,说明富集的基因越多,圆点颜色越红,说明富集的可信度越大。图5 KEGG信号通路富集分析

2.6 防己黄芪汤关键活性成分与核心靶点分子对接将槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花黄素四个关键活性成分与PPI网络中筛选的核心靶点IL-6、PPARG、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、EGFR、HIF1A进行分子对接,结果见表2,图6。一般认为,当配体与受体结合能量越低时,其结合构象越稳定,相互作用的可能性越大,当最低化学结合能<0 kcal·mol-1

注:图中关键成分与靶点交叉点的颜色代表其分子对接结合能的大小,颜色越红,代表其结合能越高;颜色越蓝,代表其结合能越低。图6 防己黄芪汤关键药物活性成分与核心靶点的分子对接结果热图

表2 防己黄芪汤关键活性成分与核心靶点的分子对接结果 (kcal·mol-1)

时可以在自然状态下对接;最低化学结合能<-5 kcal·mol-1时,对接结果良好;结合能<-7.0 kcal·mol-1表示受体与配体之间具有强烈的结合活性[8-9]。根据分子对接结果可知,关键活性成分与核心靶点均具有良好的结合活性。而HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR与关键活性成分结合能较低,因此上述4个蛋白是治疗靶点的可能性更大,其中PPARG涉及脂质与动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝信号通路;HIF1A涉及卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、化学致癌-活性氧、HIF-1信号通路、癌症中的蛋白聚糖信号通路;CASP3涉及脂质与动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、麻疹、酒精性肝病、TNF信号通路、大肠癌、弓形虫病、丙型肝炎、EB病毒感染、乙型肝炎、IL-17信号通路、人巨细胞病毒感染、细胞凋亡、铂类耐药性、p53信号通路、非酒精性脂肪肝、癌症中的蛋白聚糖、细胞凋亡信号通路;EGFR涉及化学致癌-受体激活、化学致癌-活性氧、前列腺癌、大肠癌、丙型肝炎、内分泌抵抗、人巨细胞病毒感染、乳腺癌、HIF-1信号通路、胰腺癌、癌症中的蛋白聚糖、肝细胞癌、子宫内膜癌等。相关蛋白涉及的信号通路及蛋白间的网络图见图7。其中PPARG、HIF1A与关键活性成分(槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花黄素)之间具有强烈的结合活性,因此运用PYMOL 2.5.0软件对分子对接结果进行可视化,见图8。

3 讨论

肥胖是由遗传和环境等因素共同作用,导致机体总脂肪含量过多和/或局部脂肪含量增多及分布异常的慢性代谢性疾病[10],其常导致或伴发心血管疾病、2型糖尿病、癌症和胆囊疾病等[11]。虽然饮食、身体活动和行为改变是减重的基石,但仅通过改变生活方式实现的体质量减轻通常是有限的并且难以维持,而且从长远来看是无效的[12],因此药物治疗的手段必不可少。目前用于治疗肥胖的药物主要有奥利司他、利拉鲁肽等[13],但其胃肠道反应常导致患者不能耐受,而针灸、中药等传统中医药疗法是减重的有效方法[14-15],其易于接受,引起的不良反应相对较少。

中医认为肥胖的发生多与饮食不节、多逸少劳、脾虚不运、肾阳虚衰、肝气郁结等因素有关[16],在2021年《基于临床的肥胖症多学科诊疗共识》[4]中指出,依据肥胖的病因病机进行辨证分型论治是治疗肥胖症的有效手段之一,推荐防己黄芪汤治疗脾虚不运型肥胖。一项临床研究结果表明,防己黄芪汤能够有效降低肥胖患者的BMI和血脂,且可调节瘦素(leptin)、神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)水平[17]。

目前,尚无防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的作用机制研究,因此,本研究基于网络药理学和分子对接技术探讨防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的作用机制,为后续围绕其关键靶点与信号通路进一步深入开展实验研究提供方向。

本研究通过防己黄芪汤作用靶点和单纯性肥胖靶点蛋白取交集,获得潜在治疗靶点61个;潜在的治疗靶点通过扩展的网络分析,筛选出前8位关键治疗靶点,即IL-6、PPARG、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、EGFR、HIF1A;而结合分子对接结果显示,HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR与关键活性成分结合能的绝对值排名靠前,因此上述4个蛋白是治疗靶点可能性更大。缺氧抑制因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF1A)是一种高度保守的转录因子,在组织对缺氧的反应中起关键作用,在肥胖的脂肪组织中表达增加[18],从而诱导白色脂肪组织纤维化和炎症,导致肥胖相关的代谢功能障碍[19]。CASP3是一种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,在多细胞生物中高度保守,作为细胞凋亡的中枢调节因子[20],可以诱导脂肪细胞的凋亡[21]。PPARG主要在白色和棕色的脂肪组织中表达,与靶基因启动子调控序列结合,作为调节脂肪组织中前脂肪细胞分化的关键因子,在调节脂肪细胞代谢中起重要作用[22];EGFR是受体酪氨酸激酶ErbB家族的成员,在调节脂肪组织的存活、增殖、迁移和分化中起着核心作用,可以调控下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/Akt途径影响糖酵解和葡萄糖转运,改善胰岛素抵抗[23]。

HIF1A表达增加受EGFR/MEK/ERK通路的激活控制[24],而HIF1A可诱导产生和分泌血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)。分泌到微环境中的PDGF通过作用于脂肪前体细胞表达的PDGF受体,从而激活胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK),特异性地磷酸化PPARG,从而抑制PPARG活性以及脂肪前体细胞的分化潜能[25]。CASP3转化为其活性形式被认为是细胞死亡信号级联中的关键过程[26],而有研究结果显示,抑制HIF1A蛋白水平可以诱导脂肪细胞CASP3的表达[27],进而促进脂肪细胞的凋亡。因此,HIF1A、EGFR、PPARG、CASP3可共同调控脂肪细胞的分化与凋亡。

GO富集分析结果表明,潜在的作用靶点主要集中在类固醇激素反应、活性氧代谢过程、缺氧反应等生物学过程,定位在薄膜筏、膜微区、膜区、囊泡腔等细胞部位,影响核受体活性、转录因子活性,类固醇激素受体、细胞凋亡过程、氧化还原酶活性等分子功能,调节脂肪细胞的生命活动。KEGG 富集分析显示,防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的重要信号通路包括脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、细胞凋亡、p53信号通路、胰岛素抵抗、HIF-1信号通路、非酒精性脂肪肝等。脂肪毒性诱导的肝脏炎症与肥胖引起的脂肪组织改变和重塑有关,导致非酒精性脂肪性肝病。脂联素及其同源受体,特别是肝脏中的脂联素受体-2的全面串扰通过与肝PPARG的相互作用改善肥胖诱导的非酒精性脂肪性肝病[28]。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一种重要的转录因子,可诱导人类癌症低氧条件下的适应性反应[29],通过下调HIF-1信号通路中Akt1和HIF-1α的蛋白表达,上调VEGFA蛋白表达[30],可以促进微血管生成,改善细胞氧供。AGEs与AGE受体相互作用,产生氧化应激、炎症、胰岛素抵抗和细胞衰老等生物过程;有研究表明,脂肪细胞中AGE/RAGE轴在调节肥胖和胰岛素抵抗中具有关键作用;另外,RAGE可以上调Caspase 3,从而诱发细胞死亡[31-32]。TNF信号传导途径的关键基因有Ptgs2和Socs3、Caspase-3基因[33]。细胞膜上TNFR1在与活性形式的TNF-α结合后,可以激活Caspase等凋亡级联反应,诱发细胞凋亡[34]。IL-17是一个重要的促炎症细胞因子,由辅助性T细胞17(helper T cell 17,Th17)及先天性免疫细胞等分泌,在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用[35];IL-17信号通路主要活化核转录因子-κB信号通路、蛋白酪氨酸激酶/信号转导及转录激活因子信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 信号通路和丝裂原活化蛋白激酶信号通路,从而导致炎症、肿瘤细胞增殖、细胞凋亡等多个生理过程[36]。因此,防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的重要通路与炎症、氧化过程、胰岛素抵抗、细胞凋亡等通路密切相关。

分子对接的结果显示,槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花黄素与关键靶点结合良好,其中槲皮素、山柰酚、异鼠李素分子对接结果更优。有实验研究表明,槲皮素能够抑制脂肪细胞和巨噬细胞中的MAPK信号因子ERK1/2、JNK、p38MAPK以及 MCP-1、TNF-α和炎性细胞因子IL-1β和IL-6的分泌,并刺激抗炎细胞因子IL-10的分泌,从而抑制脂肪形成和炎症相关细胞因子的表达[37]。山柰酚可抑制TLR4/NF-κB通路来改善肠屏障完整性并抑制肠道炎症以及调节肥胖盲肠微生物群的生态失调[38]。另有一些研究显示,山柰酚可能通过调节下丘脑中枢以达到减重效果[39]。异鼠李素可以降低内质网应激标志物和产脂酶的mRNA表达以减少肝脏脂质含量[40],亦有抗炎、减少高糖高脂诱导胰岛β细胞凋亡的作用[41]。

综上所述,本研究通过网络药理学与分子对接分析防己黄芪汤治疗单纯性肥胖的潜在靶点及作用机制,发现防己黄芪汤治疗单纯性肥胖可能的核心活性成分是槲皮素、山柰酚、异鼠李素等,潜在关键靶点是 HIF1A、CASP3、PPARG、EGFR等,关键信号通路包括AGE-RAGE、TNF、IL-17、细胞凋亡、p53、胰岛素抵抗、HIF-1、非酒精性脂肪肝等。提示,防己黄芪汤可以通过多组分、多靶点、多通路协同机制治疗单纯性肥胖,是临床治疗单纯性肥胖的基方,后续将进一步对关键靶点与信号通路开展实验及临床研究。