线粒体相关内质网膜-细胞凋亡途径在动脉粥样硬化发病中的作用*

赵微,王帅

辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110031

线粒体相关内质网膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)是内质网(endoplasmic reticulum,ER)与线粒体两者之间的偶联区域,构成其通讯的物理基础,可以在不同的信号通路中进行生物分子快速交换。MAMs的不同蛋白质组学分析发现,MAMs中有上百个不同的蛋白质,这些蛋白质广泛参与了多个细胞过程。MAMs通过物理连接的平台效应和其独特的脂质与蛋白质发挥作用,目前MAMs在脂质的合成与转运、氧化应激、钙稳态的维持、炎症反应、细胞凋亡以及自噬等过程中的作用已经被逐步证实,而这种种因素,尤其是细胞凋亡都是诱发心血管疾病的高危因素[1]。MAMs上富集蛋白是心血管疾病治疗的潜在新靶点,内质网-线粒体通讯中断或缺失在各种心血管疾病,如HF、PAH和血管疾病的发病机制中至关重要。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性多因素性血管疾病,是诱发冠心病、脑梗死、脑出血、外周血管病等多种心脑血管疾病的主要因素[2],因此AS的积极防治对降低心血管疾病的发生及恶化具有鲜明的现实意义。

1 MAMs与细胞凋亡

维持细胞内稳态涉及多个细胞器的参与,这些细胞器在时间和空间上相互关联,在功能上相互配合或拮抗。研究表明细胞器之间,特别是ER和线粒体之间的信号转导是影响细胞命运的一个不可忽视的因素。ER作为蛋白质折叠和修饰的细胞中心,可以通过调节蛋白质的数量和质量影响一系列生理过程。细胞的“能量工厂”——线粒体也参与了细胞凋亡,ER是细胞应激的传感器,线粒体则是细胞应激反应的促动器,ER和线粒体之间进行的双向交流能够进一步影响细胞凋亡过程。最近的研究证实,凋亡信号可以在两个细胞器之间穿梭,MAMs则在ER和线粒体之间的复杂串扰中起着至关重要的作用,并且介导细胞凋亡,进而影响细胞命运。在内质网合成、Ca2+稳态调节、ER线粒体功能协调以及ER和线粒体之间死亡信号转导等方面都有MAMs的介导。MAMs中的死亡信号以多种形式参与,如Ca2+从ER转移到线粒体,调节蛋白质-蛋白质相互作用,分子易位或控制脂质代谢。在应激条件下,ER作为传感器会立即做出反应。同时,如果应激强度超过ER的适应性,会向线粒体传递凋亡信号,启动凋亡事件。其传导途径如下:(1)ER向线粒体灌注Ca2+,线粒体中大量Ca2+作为死亡信号启动细胞凋亡;(2)磷酸簇分选蛋白-2(phosphofurin acidic cluster sorting protein 2,PACS-2)由ER向线粒体易位,伴随免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,Bid)活化和易位,导致线粒体外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)通透性增加,促凋亡因子释放;(3)神经酰胺的合成和积累引起OMM通透性增加,诱导细胞色素C(cytochrome C,CytC)或其他促凋亡物质在膜间空间释放和应激信号从ER传递到线粒体;(4)线粒体分裂蛋白-1(mitochondrial fission protein,Fis-1)作为线粒体凋亡的下游分子可以通过裂解BAP31(B细胞受体相关蛋白)将凋亡信号传回ER。凋亡信号的ER-线粒体-ER扩增环有助于协调两个细胞器之间的凋亡事件[3]。见图1。

图1 细胞凋亡通路示意图

1.1 MAMs与钙稳态ER与线粒体之间的Ca2+转运对线粒体稳态和能量的维持至关重要,但不受限制的Ca2+转移可能导致线粒体Ca2+超载,线粒体损伤及细胞凋亡。ER是细胞内的一个精细的膜系统,通过广泛的膜结构与其他细胞器产生结构与功能上的交互,参与细胞内Ca2+储存与流动。内质网钙平衡主要由位于内质网膜上的蛋白雷尼啶受体、1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)和钙泵维持。在生理状态下,内质网腔中Ca2+的浓度高于细胞质中的Ca2+浓度,正常状态下ER中的钙离子呈游离状态,RyR和IP3R两种受体负责将游离的Ca2+由内质网腔转移到细胞质内,然后又通过钙泵将细胞质中的钙离子摄取回到ER中[4],以此维持钙平衡。在应激状态下,ER不仅会直接释放Ca2+进入细胞质,Ca2+也很有可能通过“IP3R1/GRP75/VDAC1钙离子通道”流入线粒体。IP3R的亚基IP3R1是参与ER与线粒体之间钙流动的复合蛋白IP3R1/GRP75/VDAC1的成员之一,也是ER-线粒体偶联结构MAM的主要成分,在两大钙库间维持钙平衡。线粒体外膜电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channels,VADC)介导线粒体内外多种代谢物和离子的运动,并参与细胞凋亡、物质代谢和Ca2+的调节等一系列细胞过程[5]。葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75,GRP75)连接IP3R1和VDAC构成“IP3R1/GRP75/VDAC1钙离子通道”维持MAMs的结构。电子断层扫描技术检测到MAMs与线粒体膜相距仅10～25 nm,极近的距离为内质网中的钙离子能够迅速流向线粒体提供了便利。线粒体-Ca2+单向转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter,MCU)也集中在MAMs结构,调节内质网上钙离子单向转移至线粒体。IP3R1打开时钙离子从ER释放出,引起MAMs局部钙离子浓度增高,同时钙离子通过MCU进入线粒体。心肌细胞中糖原合成酶激酶-3β与IP3R1相互作用可以改变线粒体渗透性进而调控线粒体钙离子稳态,线粒体通透性转换孔的重要组成分子亲环素D(cyclophilin,CypD)与VDAC/GRP75/IP3R1蛋白复合物相互作用,也可介导钙离子从内质网流向线粒体[6]。线粒体摄取过量Ca2+会导致其功能紊乱,释放细胞色素氧化酶等多种物质[7],诱导Bcl-2相关促凋亡蛋白的寡聚和激活,促进OMM的透化作用,各种促凋亡因子释放,启动细胞内源性凋亡通路[8]。

1.2 MAMs与氧化应激线粒体中过量的Ca2+可与心脏磷脂结合,促进呼吸链复合体II的解体,导致多个亚基的释放,同时伴随过量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的产生,启动应激机制[9]。MAMs介导细胞内ROS引起的氧化损伤,来自内质网的过量的Ca2+会引起线粒体嵴产生大量活性氧,并且在MAMs处生产氧化还原纳米域,产生内质网应激诱导的内源性细胞凋亡。Ca2+就像一把双刃剑,既能促进新陈代谢,又能促使细胞凋亡。Ca2+通量决定了哪些细胞事件发生,从而也突出了MAMs结构对细胞的重要性。MAMs与氧化应激联系另一方面表现在MAMs结构上的某些分子能直接促进ROS产生,氧化激活的蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ,PKCβ)诱导存在于线粒体基质、线粒体内外膜之间的磷酸化酪氨酸信号适配蛋白(66 kDa isoform of the growth factor adapter Shc,p66Shc)的36位丝氨酸磷酸化,使p66Shc转移至MAMs 进而产生 ROS,促进多种心血管疾病的发展。MAMs可以通过Ero1和p66Shc直接产生ROS。Ero1包括Ero1-α和Ero1-β两种亚型,其中75%的Ero1-a定位于MAMs上。Ero1是ER中控制氧化还原稳态的重要分子,其表达增高可引起ROS产生增多。生物或细胞应激状态下产生的氧化应激会破坏其DNA和蛋白质,产生氧化应激损伤。面对干扰机体亦会激活其特殊的防御机制来对抗ROS水平的升高,以保护其免受氧化损伤。在氧化损伤以及一些实体肿瘤和髓系白血病细胞中存在一种抗氧化、抗炎、抗凋亡和促进血管生成的微粒体应激蛋白血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1),在应激状态下被诱导激活,以截断和酶活性不活跃的形式迁移到细胞核[10]。核因子红系2相关因子(nuclear factor erythroid 2 related factor,Nrf2)是一种转录因子,也是许多抗氧化剂和抗凋亡蛋白(包括HO-1)的主要调节因子,也会随着氧化损伤和各种类型的癌症在细胞核中积累。在氧化应激中,核HO-1与Nrf2两者协同作用,通过糖原合成酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)介导的磷酸化和泛素蛋白酶体降解稳定拮抗氧化应激,延缓其在细胞核中的积累,降低氧化应激损伤以保护血管[11]。

1.3 MAMs与分子易位外源性凋亡途径主要通过细胞膜上的死亡受体与其配体结合的方式来传递凋亡信号,从而介导细胞凋亡。当细胞受到刺激时,会启动相关细胞凋亡机制,同时相关胱天蛋白酶(Caspase)被激活来执行细胞凋亡[12]。活性Caspase-8 可以直接激活 Caspase-3/6/7 以执行细胞凋亡,也可以通过裂解Bid,同时伴随Bid向线粒体易位,激活内源性细胞凋亡途径,诱导细胞凋亡。PACS-2是位于内质网膜上的一种分选蛋白,参与ER的稳态调节、脂质合成以及MAMs的结构连接,在线粒体、内质网和溶酶体稳态中发挥重要作用。PACS-2也介导凋亡信号从ER转导到线粒体的过程,高水平的ER可导致全长Bid结合的 PACS-2从ER转位到线粒体,然后Bid被caspase-8在线粒体表面切割,截短的Bid易位到线粒体后引起大量促凋亡蛋白的聚集,激活线粒体凋亡途径,同时促进OMM通透性增加和细胞色素C释放,进一步引发不可逆的细胞凋亡。

1.4 MAMs与脂质代谢MAMs上存在脂质代谢的相关蛋白,其主要功能是参与脂质从ER到线粒体的转运,在脂质代谢中起核心作用。MAMs中合成了多种脂类,目前已知有几种脂质代谢物可以影响细胞的命运,其中神经酰胺是最典型的[13]。正常情况下,神经酰胺是通过神经酰胺合成酶途径合成的。然而在应激条件下(如热休克、化疗、毒素、辐射等因素),神经鞘磷脂酶中的鞘磷脂可以快速合成神经酰胺[14]。神经酰胺的积累不仅可以(直接或间接)调控多种参与凋亡信号转导的分子,还可以导致OMM形成孔道,诱导细胞色素C等促凋亡因子释放,影响细胞凋亡。

2 细胞凋亡与AS

机体过多或过少的细胞凋亡能够影响多种疾病的进展[15]。病理状态下,血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)和巨噬细胞凋亡被认为是AS疾病启动和发展的关键参与者[16]。研究表明AS斑块破裂或侵蚀是心血管疾病患者猝然发病和死亡的主要原因,造成多种急性心血管事件发生[17]。

2.1 血管内皮细胞凋亡与AS作为血管抵御外界侵袭的第一道防线,血管内皮细胞紧密排列在机体整个循环系统中,通过抗炎、抗血小板聚集、抗凝和调节血管生成等方式来保护和维持血管功能[18]。VEC大量过度凋亡会直接破坏血管内壁完整性,释放出大量血管内细胞黏附分子,单核细胞与之结合进入内膜形成巨噬细胞,最终结合相关蛋白转化为泡沫细胞——斑块形成的标志物。

2.2 血管平滑肌细胞凋亡与ASAS 病变晚期VSMC过度凋亡会导致纤维帽不断变小和变薄,增加斑块不稳定性和血栓形成,且大量凋亡细胞会聚集在血管壁上引起炎症反应加速AS疾病恶化[19]。因此采用抗VSMC细胞凋亡的措施在AS治疗方面具有重要临床意义。

2.3 巨噬细胞凋亡与AS在病理状态下,巨噬细胞凋亡一定程度上可扮演组织修复的角色,也能够促进疾病恶化,而且在疾病的不同阶段特性不一,作用复杂多元[20]。在AS发生早期,巨噬细胞凋亡可抑制疾病发展,有利于AS治疗。在晚期AS中,由于机体清除坏死物质和组织修复能力减弱,巨噬细胞凋亡会导致坏死碎片聚集,促进动脉粥样硬化斑块形成[21]。

3 MAMs-细胞凋亡通路与AS的相互作用

关于MAMs-细胞凋亡通路的形成对于AS病理改变的作用有着多方面多角度的探讨,一方面MAMs可通过促进线粒体自噬进而抑制 VSMC凋亡,抑制动脉粥样硬化斑块破裂[22]。也有研究认为血管内皮细胞上的MAMs促进ER中的钙离子过量转移至线粒体,影响钙平衡,导致内皮细胞凋亡,加剧动脉粥样硬化斑块的形成和不稳定性。而形成斑块的巨噬细胞和T细胞中MAMs的增多能够促进炎症因子的不断释放,引起动脉粥样硬化[23]。在内源性凋亡通路中,AS中氧化型低密度脂蛋白 (human oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)可降低抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的比例,抗凋亡蛋白减少从而更容易诱发细胞凋亡;在外源性细胞凋亡通路中,AS中巨噬细胞ox-LDL激活细胞膜表面的死亡受体介导细胞凋亡[24];内质网应激凋亡通路是目前新研究的凋亡通路,尚未有完整明确的机制,但内质网应激已经被证实与多种心血管疾病动物模型相关[25],如缺血性心肌病、心肌肥厚及心力衰竭等[26]。在相关临床疾病模型的研究中,细胞发生内质网应激还会激活其相关炎症因子[27]和自噬等机制参与疾病的发展。相关研究表明,AS中巨噬细胞凋亡的过程中伴随有钙转移的发生,促进凋亡通路的启动。内质网应激通路中也存在跨膜钙梯差的变化[28]。显然二者均存在细胞内钙离子的浓度改变,间接表明内质网应激通路可以通过改变细胞内钙平衡参与影响细胞凋亡,进而作用于AS疾病。因此MAMs-细胞凋亡通路可能为治疗AS疾病提供新的角度与方向。

4 中医理论与MAMs-细胞凋亡通路的相关性

从中医角度而言,根据AS导致的心脑血管疾病的临床表现与疾病特点,其中医病机多为本虚标实,临床上从痰、瘀、毒、虚论述AS。治疗AS当活血化瘀、清热利湿等,通过多种药物配伍,达到多成分、多靶点、多途径的综合调节作用[29]。治疗AS疾病的代表性中药多为补益类中药,如人参、黄芪;祛瘀类中药,如三七;清热解毒类中药,如黄连等。细胞凋亡的发生与炎症、氧化应激等密切相关,抑制细胞凋亡与中医运用活血祛瘀、解毒除湿之理法方药有异曲同工之效。相关研究证实中医药某些活性成分作用于相关因子抑制细胞坏死性凋亡能够增强AS防治效果[30]。

5 中医药干预细胞凋亡通路治疗AS

中药因其特有的药理活性发挥独特作用。随着科技发展对中医药探究逐渐深入,中医药治疗AS疾病已在临床上得到广泛应用,而中医药介导调控细胞凋亡影响AS疾病成为目前研究热点之一[31]。因此,探究中医药干预MAMs-细胞凋亡通路的具体作用机制,对防治AS具有重要意义。相关研究证实某些中药特有成分及中药方剂能够基于MAMs-细胞凋亡通路发挥其药效,在AS疾病进展中起到治疗作用[32]。相关文献表明含有黄酮类、生物碱类、多酚类等成分的中药能够通过抑制氧化应激,介导细胞自噬,延缓细胞凋亡来控制AS病程;含有三萜类、皂苷类以及多酚类等成分的中药能够抑制细胞焦亡及铁死亡相关通路,进而减缓斑块形成和促进斑块稳定性。

6 讨论

目前对于心血管疾病的分子机制研究是多角度、多维度的,一方面包括干预各种炎症通路、自噬机制、免疫机制、血管生成机制、基因转录调控等分子生物学及免疫学;另一方面则是研究细胞的显微结构层面——细胞器的功能以及细胞器间的交互作用。近年来逐渐认识到ER-线粒体偶联结构——MAMs参与了各种疾病发生发展。尽管MAM在20世纪60年代就已经被电子显微镜观察到,但是其在心血管系统中的作用是近20年才开始认识到。心血管疾病由多种危险因素和病理机制引起[33]。在细胞水平上,各种畸变包括代谢异常、能量缺乏、自噬缺陷、内质网应激、ROS产生和细胞凋亡激活,都可能导致心血管疾病发生[34]。不可否认MAMs与这些细胞过程之间关系密切,与细胞生存命运相关,是全身各系统疾病包括心血管疾病治疗的靶点,也是动脉粥样硬化防治的新方向。