血清miR-134-5p和miR-320a检测联合肺功能指标对煤工尘肺患者的早期诊断价值

熊高才　杨元凤　李家松　刘廷谦　何冰冰　刘卓令

摘要：目的 探討血清miR-134-5p和miR-320a联合肺功能指标对尘肺患者早期临床诊断价值。方法 选取煤工尘肺（CWP）患者（CWP组）、煤矿接尘体检人群（接尘组）以及同期健康体检人群（对照组）各40例；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测各组血清miR-134-5p和miR-320a水平。检测各组受试者的肺功能指标：最大通气量（MVV）、用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼气容积（FEV1）、第3秒用力呼气容积（FEV3）、1秒率（FEV1/FVC）、3秒率（FEV3/FVC）、最大呼气中期流量（MMEF）、峰流速（PEF）、75%呼气流速（MEF75）、50%呼气流速（MEF50）、25%呼气流速（MEF25）、残气量/肺总量（TLC）、功能残气量（FRC）和肺泡通气量（VA）；采用Logistic回归分析煤矿接尘相关作业的人群发生CWP的危险因素；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析miRNA联合肺功能指标对CWP患者的早期诊断价值。结果 对照组、接尘组和CWP组血清miR-134-5p、miR-320a表达水平，MVV、FEV1、FEV1/FVC、MMEF、MEF50、FRC和VA逐渐降低（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析结果发现FRC降低是煤矿接尘人群发生CWP的独立危险因素（P＜0.05）。miR-134-5p和miR-320a联合肺功能指标FRC预测煤矿接尘相关作业的人群发生CWP的诊断效能较高，AUC为0.975（95%CI：0.948～1.000）。结论 血清miR-134-5p、miR-320a和肺功能指标FRC联合对早期CWP的临床诊断具有重要参考价值。

关键词：煤尘肺；功能残气量；呼吸功能试验；miR-134-5p；miR-320a

中图分类号：R563.9文献标志码：ADOI：10.11958/20221645

Early diagnostic value of serum miR-134-5p and miR-320a combined with pulmonary function index in coal worker pneumoconiosis patients

XIONG Gaocai YANG Yuanfeng LI JiasongLIU Tingqian HE Bingbing LIU Zhuoling

1 Department of Respiratory and Critical Care， the Third People's Hospital of Guizhou Province， Guiyang 550008， China;

2 Department of Pharmacy， the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine

Corresponding Author E-mail： 369400274@qq.com

Abstract： Objective To explore the value of serum miR-134-5p and miR-320a combined with pulmonary function indexes in the early clinical diagnosis of pneumoconiosis. Methods Forty cases of coal workers' pneumoconiosis （CWP）， 40 cases of coal mine dust exposed physical examination population and 40 cases of healthy physical examination population in the same period were included in this study. Expression levels of serum miR-134-5p and miR-320a were detected by qRT-PCR assay. Lung function indexes were detected in three groups， including maximum ventilation volume （MVV）， forced vital capacity （FVC）， forced expiratory volume 1 （FEV1）， forced expiratory volume 3 （FEV3）， FEV1/FVC， FEV3/FVC， maximum mid-expiratory flow （MMEF）， peak expiratory flow （PEF）， 75 % maximal expiratory flow （MEF75）， 50% maximal expiratory flow （MEF50）， 25% maximal expiratory flow （MEF25）， residual volume （RV）， RV/total lung capacity （TLC）， functional residual capacity （FRC） and alveolar ventilation （VA）. Logistic regression was used to analyze risk factors of CWP in coal mine dust-related operations. Receiver operating characteristic （ROC） curve was used to analyze the early diagnostic value of miRNA combined with pulmonary function index in patients with CWP. Results The expression levels of serum miR-134-5p， miR-320a， MVV， FEV1， FEV1/FVC， MMEF， MEF50， FRC and VA were decreased gradually in the control group， the dust exposure group and the CWP group （P＜0.05）. Multiple Logistic regression analysis showed that the decrease of FRC was an independent risk factor for CWP in coal mine dust exposure population （P＜0.05）. miR-134-5p and miR-320a combined with lung function index FRC showed high diagnostic efficacy in predicting CWP disease in coal mine dust-related operations， with an AUC of 0.975 （95%CI： 0.948-1.000）. Conclusion The combination of serum miR-134-5p， miR-320a and lung function index FRC has important reference value for the clinical diagnosis in patients with early CWP.

Key words： anthracosis; functional residual capacity; respiratory function tests; miR-134-5p; miR-320a

煤工尘肺（coal workers pneumoconiousis，CWP）是一种常见的职业病，患者普遍存在肺纤维化、支气管扭曲或狭窄及慢性阻塞性肺疾病等并发症。此外，肺组织中的煤尘颗粒可能具有毒性作用，引起氧化应激、DNA损伤和慢性炎症反应等［1］。CWP早期症状较轻，易被漏诊、误诊，但病情会逐年加重，直接损伤肺功能，患者出现换气功能障碍，呼吸衰竭。由于早期难诊断且无特效治疗药物，CWP已成为我国重大的公共卫生问题，寻找有效的生物标志物对尘肺的预防意义重大［2］。miRNA是一类由22～25个核苷酸组成的单链RNA［3］，对机体生长发育、能量代谢与免疫反应等生理病理过程具有重要作用，游离miRNA具有作为某些人类疾病的生物标志物的潜力［4-5］。CWP发展过程中伴随miRNA表达异常［6］，但miRNA结合肺功能指标预测CWP肺纤维化的研究较少。在小鼠肺纤维化模型中，miR-320a-3p可通过靶向叉头框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）mRNA调节纤维化程度［6］；通过微阵列和生物信息学方法发现肺纤维化患者血清miR-134-5p和miR-320a存在差异性表达［7］，miR-134-5p和miR-320a可能参与了尘肺纤维化过程。本研究将miR-134-5p和miR-320a联合肺功能指标用于CWP早期诊断，为尘肺病的早期预防提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究對象

选取2020年1月—2021年1月贵州省第三人民医院呼吸及危重症科就诊的CWP患者（CWP组）、煤矿接尘体检人群（接尘组，从事煤矿接尘相关作业的人群）以及同期健康体检人群（对照组）各40例。CWP组纳入标准：（1）由具有职业病诊断资质的尘肺诊断专家根据《职业性尘肺病的诊断》（GBZ70-2015）确诊为CWP。（2）未罹患其他重大肺部疾病。接尘组纳入标准：（1）从事煤矿接尘相关作业，未确诊为CWP。（2）无重大肺部疾病。全部研究对象均签署知情同意书。CWP组均为男性，年龄（39.07±3.87）岁；接尘组均为男性，年龄（39.30±4.48）岁；对照组均为男性，年龄（38.33±7.39）岁。3组间年龄（F=0.349）差异无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测血清miR-134-5p和miR-320a表达水平

入组后采集对象肘部静脉血5 mL，3 500 r/min离心1 h，将上清液转移至干净的1.5 mL EP管中，-80 ℃储存备用。采用凯杰生物工程（深圳）有限公司miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit试剂盒提取各组样本血清miRNA。室温解冻备用血清，加入适量的裂解液和蛋白酶，56 ℃孵育30 min，80 ℃孵育30 min后，12 000 r/min离心5 min，取上清液，加入离心柱，分离miRNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miR-134-5p（169 bp）上游：5'-UGUGACUGGUUGACCAGA-3'，下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；miR-320a（203 bp）上游：5'-AAGGGATCGCGGGCG-3'，下游：5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'；内参U6（103 bp）上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 1 min，退火61 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 40 s（40个循环）。根据得到的Ct值，采用2^-ΔΔCt法计算miRNA相对表达量。

1.3 肺功能检测

根据我国《职工工伤与职业病致残程度鉴定》GB/T 16180-2014中因职业接触粉尘而引起的尘肺病患者肺功能检测要求，各组受试者入院后或体检时需检测：最大通气量（MVV）、用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼气容积（FEV1）、第3秒用力呼气容积（FEV3）、1秒率（FEV1/FVC）、3秒率（FEV3/FVC）、最大呼气中期流量（MMEF）、峰流速（PEF）、75%呼气流速（MEF75）、50%呼气流速（MEF50）、25%呼气流速（MEF25）、残气量（RV）/肺总量（TLC）、功能残气量（FRC）和肺泡通气量（VA）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0进行数据分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间多重比较采用Sidaks检验。计数资料以例表示，组间比较采用χ2检验。采用单因素和多因素Logistic回归分析煤矿接尘相关作业人群发生CWP的危险因素。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析miRNA联合肺功能指标对CWP的早期诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清miR-134-5p和miR-320a水平比较

对照组、接尘组和CWP组血清miR-134-5p和miR-320a表达水平逐渐降低（P＜0.05），见表1。

2.2 各组肺功能指标比较

对照组、接尘组和CWP组MVV、FEV1、FEV1/FVC、MMEF、MEF50、FRC和VA逐渐降低（P＜0.05），见表2。

2.3 发生CWP的危险因素分析

以MVV、FEV1、FEV1/FVC、MMEF、MEF50、FRC、VA、miR-134-5p和miR-320a为自变量，煤矿接尘人群是否发生CWP（否=0，是=1）为因变量，进行单因素Logistic回归分析，结果发现FEV1、FEV1/FVC、MMEF、FRC、miR-134-5p和miR-320a是煤矿接尘人群发生CWP的影响因素（P＜0.05），见表3。以FEV1、FEV1/FVC、MMEF、FRC、miR-134-5p和miR-320a为自变量，煤矿接尘人群是否发生CWP（否=0，是=1）为因变量，进行多因素Logistic回归分析，结果发现FRC降低是煤矿接尘人群发生CWP的独立危险因素（P＜0.05），见表4。

2.4 ROC曲线分析

血清miR-134-5p、miR-320a联合肺功能指标FRC预测煤矿接尘相关作业的人群发生CWP的诊断效能较高，见表5、图1。

3 讨论

我国作为煤炭资源大国，从事煤炭行业的人员数量巨大，CWP发病率居世界首位［8］。长期吸入煤颗粒可导致多种肺部疾病，如CWP、进行性大面积纤维化、慢性支气管炎、肺功能丧失和肺气肿等［9］。CWP早期是指接尘人群接触粉尘，但尚未被诊断为CWP，该时期可持续20～30年。临床上针对CWP通常是根据确切的粉尘接触史，结合肺影像学和分子生物学检测结果进行诊断［10］。然而，患者肺部在没有典型病理改变的情况下，临床医师很难做出准确诊断。目前，临床上针对CWP主要通过对症治疗减轻患者病痛，而肺泡灌洗术作为探索性的治疗方法，其术中和术后均存在发生并发症的风险［11-12］。因此，寻找血清生物标志物联合肺功能相关指标用于尘肺发病早期的预测和诊断具有重大意义。

miRNAs通过靶向特定的mRNA导致靶基因的转录后沉默来调节基因表达，参与调节多个细胞进程，如细胞周期进展、增殖、凋亡和发育。人体内超过30%的编码基因受到miRNA的调控［13］。研究发现，当患者长期受到各种化学刺激和空气污染等威胁时，肺组织内miRNAs表达出现异常，并引起蛋白质异常表达，导致肺部疾病的发生发展［14］。因此，肺组织内miRNAs的异常表达可能是诊断尘肺的潜在临床生物标志物［15］。本课题组前期通过miRNA芯片技术筛选出了miR-134-5p和miR-320a两个在CWP患者中异常低表达的miRNAs，并且通过本研究验证了CWP患者血清miR-134-5p和miR-320a表达水平较体检人群和煤矿接尘人群明显降低，说明miR-134-5p和miR-320a可能与煤矿接尘人群患CWP相关。

肺功能指标测定有助于判断患者肺功能障碍的性质和程度，可作为肺疾病诊断的辅助手段。尘肺患者可根据我国《职工工伤与职业病致残程度鉴定》GB/T 16180-2014中因职业接触粉尘而引起的尘肺病患者肺功能检测要求执行尘肺患者肺功能检测。呼吸困难是粉尘暴露对肺产生不利影响的重要临床特征，而FEV1和MMEF均能反应气道阻塞障碍情况。研究发现，FEV1与CWP患者肺部颗粒物含量呈负相关，同时FEV1降低也是尘肺患病率和死亡风险增加的重要因素［16-18］。焊工尘肺患者MMEF指标明显降低［19］，隔热纤维材料暴露工人小气道功能指标MMEF明显降低［20］。本研究发现，CWP组和接尘组患者的FEV1、MMEF和FRC均较对照组降低，且FRC是早期CWP的独立影响因素。FRC是平静呼气后肺内含气量，由补呼气容积与残气容积组成。尘肺主要影响肺部扩张，因此FRC作为肺容量的衡量指标，对尘肺检测具有一定的临床价值。另外，本研究中FEV1和MMEF不是煤礦接尘患者发生CWP的危险因素，与既往的研究结果不一致［18-20］，这可能是患者尘肺疾病背景不完全一样，既往研究中的研究对象是隔热纤维材料暴露工人，或者是焊工及煤矿工人混合的患者，而本文的研究对象主要是煤矿接尘患者；另外，研究对象所处的疾病进展期也不完全一致。本研究将miR-134-5p和miR-320a联合肺功能指标FRC进行临床诊断价值分析，结果发现与单纯miR-134-5p和miR-320a指标相比，肺功能指标联合miRNAs指标对早期CWP的诊断效能更高。

综上所述，早期CWP患者血清miR-134-5p和miR-320a表达降低，且肺功能指标FRC降低是CWP患者的独立危险因素。miR-134-5p和miR-320a联合肺功能指标FRC对早期CWP临床诊断具有良好的应用价值。但本研究样本量较少，具有地域局限性，后续还会从体内体外探究miR-134-5p和miR-320a对CWP的作用机制，为治疗CWP提供可靠的潜在标志物。

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（2022-10-12收稿 2023-02-21修回）

（本文編辑 李志芸）