硫磺菌鉴定及人工驯化栽培研究

程天帅 卯明娟 杜雨桐 李卓宸 赵玉俊 刘迪

摘 要：硫磺菌是一种珍贵的药食兼用的大型真菌，ITS分类鉴定为奶油硫磺菌（Laetiporus  cremeiporus），对该菇进行培养条件优化研究结果为，最佳培养条件为：葡萄糖25g·L-1，酵母膏2.0g·L-1，氯化钠0.5g·L-1；驯化栽培试验出现原基，表明该菌驯化成功，本试验为开发利用及生产栽培这一野生资源奠定理论基础。

关键词：硫磺菌；鉴定；培养基优化；驯化栽培

硫磺菌（Laetiporus）又名硫磺多孔菌[1-2]，具有基内菌丝和气生菌丝[3]，子实体在药用方面有较大作用[4]，内含齿孔酸，可合成甾体药物肾上腺皮质激素，在很多疾病上有很好治疗作用[5]，多糖[6]以其它成分含量也较丰富[7]，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤作用[8]。本研究对野生硫磺菌鉴定，活性成分测定，培养基优化，驯化栽培进行研究，旨在为药用真菌资源的驯化和利用提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株：菌株于2021年6月21日采自吉林省延边朝鲜族自治州延吉市园艺农场四队苹果梨园（东经129°27′33″，北纬42°54′56″，海拔218m），其余试验材料（LH、Li、Dai）均来自延边大学农学院食药用真菌研究所。

1.2 方法

1.2.1 ITS鉴定：菌丝体DNA提取利用试剂盒，鉴定利用ITS通用引物ITS1和ITS4对DNA样本序列进行PCR扩增，产物进行测序。将获得的ITS序列利用NCBI进行比对，采用MEGA  11.0软件构建系统发育树。

1.2.2 营养成分测定：分别对4个菌株进行多糖、黄酮、三萜、多酚的测定，进行超声提取后紫外分光光度计在相应波长下测定吸光值，并带入标准曲线计算含量。

1.2.3 硫磺菌菌丝体培养基优化

1.2.3.1 单因素试验：基础培养基：葡萄糖20g·L-1、蛋白胨2.0g·L-1、

硫酸镁0.5g·L-1、琼脂20g·L-1，水1L。碳源：添加等量葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖；氮源：添加蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸铵、黄豆粉；无机盐：添加硫酸镁、氯化钠、硫酸锌、硫酸锰、磷酸二氢钾，以基础培养基不加相应物质为对照；设置3个重复，置于25℃避光培养7～10d，用十字交叉法测定菌落直径。

1.2.3.2 正交试验：对碳源、氮源、无机盐三个单因素进行正交设计选出最优组合，以确定硫磺菌的最佳培养基配方。正交设计采用L9（33）试验设计（见表1）。

1.2.4 硫磺菌培养料筛选

1.2.4.1 二级种培养基筛选：二级级种分别选用以麦麸20%、石膏1%、白糖1%为基础，分别添加杂木屑78%、棉籽壳78%、苹果梨木屑78%，以杂木屑41.5%、麦麸10%、玉米粉5%、石膏1%、白糖1%为基础分别添加棉籽壳41.5%、苹果梨木屑41.5%。以麦麸10%、玉米粉5%、石膏1%、白糖1%为基础配方，分别在两个配方中添加苹果梨木屑41.5%、棉籽壳41.5%，设置5个重复，25℃恒温培养，记录吃料速度、长势、满瓶时间。

1.2.4.2 三级种培养基筛选：三级种培养料以杂木屑、苹果梨木屑、棉籽壳为主料，在麦麸10%、石膏1%、白糖1%的栽培袋中分别加入杂木屑83%和玉米粉5%，杂木屑86%和玉米粉2%，苹果梨树木屑83%和玉米粉5%，苹果梨树木屑86%和玉米粉2%，杂木屑43%、棉籽壳43%和玉米粉2%，杂木屑54%、棉籽壳29%和玉米粉5%，苹果梨木屑54%、棉籽壳29%和玉米粉5%，设置5个重复，25℃培养，记录生长速度、生长势、菌满袋天数。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定：硫磺菌（LHJ）子实体没有着生菌柄，菌盖直生于菌丝基部，呈扇形，菌盖直径12～14cm，菌盖边缘厚度0.2～0.4cm，橘黄色，表面有白色絨毛，边缘呈波浪状，菌肉呈乳黄色，有明显沟壑（见图1）。

2.2 ITS鉴定：菌株LHJ、LH、Li为硫磺菌属（Laetiporus  Murrill）的奶油硫磺菌（Laetiporus  cremeiporus），菌株Dai为硫磺菌属（Laetiporus  Murrill）的硫色硫磺菌（Laetiporus  sulphureus），与形态学鉴定结果相符（见图2）。

2.3 活性成分分析：对4个菌株活性成分进行测定，如表2，菌株LHJ其多糖、多酚、黄酮、三萜含量均最高，且显著高于其他菌株，综合得出菌株LHJ最优，后续选取该菌株进行试验。

2.4 培养基优化

2.4.1 碳源：如表3，以葡萄糖为碳源的硫磺菌菌丝体长势最好。综合碳源的适用顺序为：葡萄糖>麦芽糖>果糖>蔗糖>乳糖。

2.4.2 氮源：菌丝体在不同氮源下均可生长，如表4，蛋白胨最佳，硝酸铵最弱，无氮源中基本停止生长。综合对5种氮源的适用顺序为：蛋白胨>黄豆粉>牛肉膏>酵母膏>硫酸铵。

2.4.3 无机盐：菌丝体在不同无机盐下均可生长，如表5，氯化钠时长势最好，硫酸锰时长势最弱，综合适用顺序为：氯化钠>硫酸锌>硫酸镁>磷酸二氢钾>硫酸锰。

2.4.6 正交试验：如表6，对硫磺菌菌丝体生长影响为碳源>氮源>无机盐，配方8菌丝生长速度最大，故最佳配方组合为A3B2C2。

2.5 原种配方对菌丝体的影响：如表7，配方5菌丝生长最慢，配方2菌丝生长速度最快为0.517cm·d-1，满瓶时间最短，为菌丝生长最适原种配方。

2.6 栽培种配方对菌丝体生长的影响：如表8，配方5菌丝生长速度最快且与其他配方差异显著，为最佳栽培种培养料配方，配方4生长最慢，在配方5、6、7、8中都出现原基，说明驯化成功。

3 讨论与结论

通过对该菌进行鉴定，结果表明该菇为硫磺菌，各菌株中LHJ多糖、黄酮、多酚、三萜含量均高于其他，为优势菌株。对该菌进行培养基优化，最佳因素为葡萄糖、蛋白胨、氯化钠，最佳组合为葡萄糖25g·L-1，酵母膏2.0g·L-1，氯化钠0.5g·L-1。最佳二级种为配方2生长速度最快。最佳三级种为配方5，且有原基出现，证明驯化成功。总之，硫磺菌分布广泛，不同来源菌株在遗传特性上可能会存在区别[7]，本研究结果可为硫磺菌培养和栽培提供一定理论依据。

参考文献

[1] 杨娟，林佩婷，赖滢妮，等.硫磺菌子实体多糖的提取及其抗氧化活性[J].福建农林大学学报，2021，50（06）：843-849.

[2] Saba  E，Son  Y，Jeon  BR，et  al.Acetyl  Eburicoic  Acid  from  Laetiporus  sulpHureus  var.miniatus  Suppresses  Inflammation  in  Murine  MacropHage  RAW  264.7  Cells.[J].Mycobiology，2015，43（2）：250-263.

[3] 兰玉菲，安秀荣，唐丽娜，等.泰山硫磺菌硫磺原變种的生物学特性研究[J].山东农业科学，2012，44（08）：46-48.

[4] 张云龙.一株野生食用菌鉴定及其生物学特性研究[D].河北工程大学，2020.

[5] 卯晓岚.中国大型真菌[M].河南科技出版社，2001.405.

[6] Body  of  Laetiporus  versisporus[J].Chemical  and  pHarmaceutical  Bulletin，2000，48（10）：1418-1422.

[7] 王艳华，朱巍巍.硫磺菌研究进展[J].食用菌学报，2023，30（03）：110.