哮喘患儿外周血炎症因子及肺功能水平与TLR4基因多态性的相关性研究*

刘洋, 王爽, 李权伦, 张超

1十堰市妇幼保健院检验科(湖北十堰 442000); 2湖北医药学院临床技能教学培训中心(湖北十堰 442002)

支气管哮喘是涉及多种细胞和炎性因子参与的以气道慢性炎症为特征的异质性疾病,这种慢性炎症与气道高反应性相关[1-3]。据不完全统计我国儿童哮喘的患病率呈逐年升高的趋势,哮喘不仅影响青少年儿童的发育和身体健康,而且影响儿童的心理健康,因此有效的预防和早期的诊疗,对减少儿童哮喘的发生具有重要意义[4-5]。研究显示哮喘的发生、发展与多个基因和环境因素密切相关[6-8],Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是模式识别受体(PPRs)的一种,TLR具有单个的跨膜的蛋白,可识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP),是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子,也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[9-11],作为Toll样受体家族成员之一的TLR4近年来受到研究者的广泛关注。TLR4可识别细菌细胞壁中的脂多糖(LPS),并可调节Th1/Th2的平衡,影响体内白细胞介素-4(IL-4)和γ干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)的水平[12-13],其与哮喘的发生、发展密切相关,但TLR4基因多态性与儿童哮喘及患儿病情预后之间的关联尚不明确,本研究旨在探索哮喘儿童外周血IL-4和IFN-γ水平及其与TLR4基因多态性的相关性,为儿童哮喘的诊疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年4月至2022年10月收治的哮喘患儿172例为实验组(男88例,女84例)。纳入标准:(1)年龄6～14周岁;(2)符合儿童支气管哮喘规范化诊治建议(2020年版)[14]诊断标准;(3)无心肺、肝脏、肾脏等器官的功能障碍;(4)无其他自身免疫缺陷症疾病或者先天性疾病。并根据患儿哮喘的严重程度,将实验组分为轻度(34例)、中度(35例)、重度(45例)和危重(58例),诊断依据见表1。选择同期在医院儿童保健科门诊体检儿童136例作为对照组,研究对象均为汉族人群。本研究通过医院伦理委员会审查(十堰妇幼-伦理-20190204),所有受试者均签署知情同意书。

表1 ≥6岁儿童哮喘急性发作严重度分级

1.2 试剂及材料 IL-4、IFN-γ测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,DNA提取试剂盒及PCR试剂盒购自购自宝生物工程(大连) 有限公司,低温离心肌购自Thermo Scientific公司,PCR仪购自公司,DYY-6C电泳仪购自北京六一仪器厂,引物设计及合成购自上海生工生物工程公司,凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司,血细胞分析仪为深圳迈瑞公司,NO分析仪购自江苏无锡尚沃公司。

1.3 方法

1.3.1 标本的采集及处理 收集纳入患者的年龄、性别等一般资料,于患者入院24 h内采集患者外周血3 mL于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)真空抗凝管,混匀,离心(3 000 r/min)10 min,分离血浆和细胞,-80℃低温冰箱保存备用。

1.3.2 IL-4、IFN-γ、外周血嗜酸性粒细胞百分率(Eos)、IgE水平的测定 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆中的IL-4、IFN-γ水平,测定方法严格按照碧云天公司产品试剂盒说明书进行操作,利用血细胞分析仪测定Eos,利用化学发光发检测血清总IgE。

1.3.3 肺功能指标第1秒用力呼气容积(FEV1)占用力肺活量(FVC)百分比(FEV1/FVC %)和呼出气一氧化氮(FeNO)的测定 肺功能检查过程中,受试者需要夹住鼻腔,用嘴呼吸,测试过程中按照医生的口令,深呼吸,然后用尽全力呼气,FEV1/FVC %=第1秒呼出气体量/最大呼气量×100%,利用便携式NO分析仪,指导受试者进行FeNO测定,共测定3次,取最佳值。

1.3.4 TLR4基因多态性的检测 按照DNA快速抽提试剂盒说明进行操作,快速抽提全血基因组DNA,NanoDrop分光光度计检测提取样本的吸光度值,A260/A280介于1.6～1.8,将提取的样本DNA于-80℃低温冰箱保存,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RELP)技术对TLR4基因多态性的检测分析,上下游引物见表2。PCR扩增条件:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环30次,之后72℃延伸 5 min。PCR扩增产物用限制性内切酶酶进行酶切,酶切产物在3.5%的琼脂糖凝胶上电泳,然后通过Bio-Rad凝胶成像系统观察结果,判断样本的基因型。

表2 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile上下游引物

2 结果

2.1 各组一般资料比较 对照组、实验组在性别、年龄、体质指数(BMI)方面比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 各组间一般资料比较

2.2 对照组和实验组哮喘患儿临床相关指标比较 实验组患儿外周血中IL-4、Eos、IgE的水平、FeNO水平显著高于对照组,而IFN-γ水平显著低于对照组;肺功能指标FEV1/FVC%显著低于对照组(均P<0.05),见表4。

表4 两组哮喘患儿临床相关指标比较

2.3 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位点单核苷酸多态性Hardy-Weinberg 遗传平衡检验 TLR9基因Asp299Gly、Thr399Ile位点的SNPs的预期基因型频率处于哈迪-温伯格平衡(HWE;P>0.05),样本具有群体代表性;实验组与对照组TLR4基因多态性位点Asp299Gly的基因型和等位基因分布相比,差异无统计学意义(P>0.05),Thr399Ile的基因型和等位基因分布相比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中实验组T等位基因分布频率显著高于对照组(P<0.05),见表5、6。TLR4基因Thr399Ile位点PCR-RFLP电泳图谱(29 bp条带在琼脂糖凝胶电泳中未能显示出),见图1。

注:Lane1、Lane4为CC基因型(406 bp);Lane2为CT基因型(406 bp、377 bp、29 bp);Lane3、Lane5为TT基因型(377 bp、29 bp)。29 bp条带在琼脂糖凝胶电泳中未能显示出

表5 各组Asp299Gly基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验及分布频率比较

表6 各组Thr399Ile基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验及分布频率比较

2.4 TLR4基因Thr399Ile多态性和哮喘患儿临床相关指标比较 TLR4基因Thr399Ile多态性与哮喘患儿外周血Eos、IgE的水平、肺功能指标FEV1/FVC%无相关性(P>0.05)。但携带Thr399Ile TT基因型哮喘患儿的IL-4和FeNO水平比高于CC和CT基因型,IFN-γ水平显著低于CC和CT基因型(P<0.05),见表7。

表7 TLR4基因Thr399Ile多态性和儿童哮喘临床相关指标比较

2.5 TLR4基因Thr399Ile多态性和患儿哮喘严重程度比较 有序logistic回归分析显示携带Thr399Ile TT基因型哮喘患儿比携带CC和CT基因型者哮喘发病程度更严重(Wald2=11.898,P=0.001),见表8。

表8 TLR4基因Thr399Ile多态性和患儿哮喘严重程度比较 例(%)

2.6 二元logistic回归分析TLR4基因Thr399Ile位点的单倍体基因型与儿童哮喘的相关性 共显性模型中,TT基因型人群是CC基因型人群患病风险的2.353倍(OR=2.353,P<0.05);显性模型中,CT+TT基因型人群是CC基因型人群患病风险的1.962倍(OR=1.962,P<0.05);隐形模型中,TT基因型人群是CT+CC基因型人群患病风险1.875倍(OR=1.875,P<0.05)。TLR4基因Thr399Ile位点的基因多态性与儿童哮喘存在相关性,TT基因型是儿童哮喘的独立危险因素。见表9。

表9 二元logistic回归分析TLR4基因Thr399Ile位点与儿童哮喘的关系 例

3 讨论

哮喘是儿童比较常见的疾病之一,主要与遗传和环境因素相关,目前虽然关于哮喘的分子机制研究已有很多,但是因其复杂的致病因素和发病机制,目前尚未明确。本课题研究旨在探索哮喘儿童外周血IL-4和IFN-γ水平及其与Toll样受体4基因多态性的相关性,为儿童哮喘的诊疗提供新的思路。

国内外研究表明[15-16]哮喘患儿体内的细胞因子和免疫细胞水平异常,外周血中IL-4主要由Th2淋巴细胞释放,IFN-γ主要由Th1淋巴细胞释放,机体内的Th1/Th2比例失衡导致2型炎症。TLR是模式识别受体(PPRs)的一种,TLR具有单个的跨膜的蛋白,可识别PAMP,是参与天然免疫的一类重要蛋白质分子。该基因编码的蛋白质是TLR家族的成员,该家族在病原体识别和先天免疫激活中起着基本作用。TLR是高度保守的,并具有结构和功能上的相似性。它们识别在传染原上表达的PAMP,并介导有效免疫力发展所必需的细胞因子的产生。作为Toll样受体家族成员之一的TLR4近年来受到研究者的广泛关注,有研究表明[17-18],TLR4途径可触发核因子-κB(NF-κB)信号通路的活化,影响基因表达的调控,进而影响机体的炎症因子和免疫细胞水平。

本研究选取172例符合纳入标准的哮喘患儿进行分析,研究结果显示,哮喘患儿外周血中IL-4水平升高,IFN-γ水平降低,而IL-4主要由Th2淋巴细胞释放,IFN-γ主要由Th1淋巴细胞释放,说明哮喘患儿机体内的Th1 /Th2比例失衡导致2型炎症。此外,哮喘患儿肺功能指标FEV1/FVC%显著低于对照组,FeNO水平比显著高于对照组,FeNO是气道上皮细胞及炎症细胞的一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生的,当气道受外界刺激诱发2型炎症时,可导致气道上皮细胞中一氧化氮合酶表达增多,从而催化L -精氨酸产生更多的NO,是目前被广泛认可的气道2型炎症的分子标志物,其不仅能反映气道炎症水平,还能预测评估抗炎效果,其检测具有无创简便的优点,在临床上得到了广泛的应用[19]。通过进一步研究发现,TLR4基因Thr399Ile多态性与哮喘患儿外周血Eos、IgE水平、肺功能指标FEV1/FVC%无相关性,但携带Thr399Ile TT基因型哮喘患儿的IL-4和FeNO水平比高于CC和CT基因型,IFN-γ水平显著低于CC和CT基因型,且TT基因型的哮喘患儿比CC和CT基因型者哮喘发病程度更严重,表明炎症反应在儿童哮喘的进展中有着重要的作用,TLR4基因、IL-4、IFN-γ可能是哮喘轻症进展成重症的关键因子,FeNO水平比可预测哮喘的严重程度。从基因水平检测发现,TLR4基因多态性位点Asp299Gly的基因型和等位基因分布差异不明显,Thr399Ile的基因型和等位基因分布存在显著差异,其中实验组T等位基因分布频率显著高于对照组,二元logistic回归分析发现TLR4基因Thr399Ile位点的基因多态性与儿童哮喘存在相关性,TT基因型是儿童哮喘的独立危险因素。但本研究纳入样本量较小,且并未进行多因素的分层分析,因此后续我们还需进一步扩大样本量,同时进一步探索不同因素对TLR4基因多态性与儿童哮喘相关性的影响。

综上所述,本研究发现TLR4 基因多态性与哮喘患儿体内免疫球蛋白IgE、Eos、肺功能指标FEV1/FVC%水平无关,但与哮喘严重程度及IL-4、IFN-γ、FeNO水平比相关,TLR4、IL-4、IFN-γ参与儿童哮喘的过程,并可能是哮喘由轻症进展成重症的关键因子,同时TLR4基因Thr399Ile位点多态性与儿童哮喘存在较大关联。

利益相关声明:本论文所有作者声明不涉及利益冲突。

作者贡献说明:刘洋为本研究的主要实施和贡献者,王爽和李权伦为本研究的参与者,张超为通信作者,参与论文的指导修改润色。