类风湿关节炎患者血浆NGAL水平与AS及AIP指数的关系*

杨平平, 李琳瑄, 刘新正, 宋沙伟, 冯新娜, 魏立

河南科技大学附属黄河三门峡医院检验科(河南三门峡 472000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)主要表现为关节滑膜慢性炎症反应,但其作为一种全身性自身免疫疾病,常累及心脏、肺脏、血液以及外周神经等多种其他组织器官,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)相关性心脑血管病变作为RA的严重并发症之一,也是导致患者死亡的关键因素[1]。而多种脂肪因子可参与神经内分泌免疫网络并发挥重要调节作用,中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)作为载脂蛋白家族的重要成员之一,其在正常生理状态下主要由骨髓释放,但当机体出现严重炎症反应,受累器官将合成和释放大量的NGAL入血,表现为血浆中NGAL浓度明显增加,且NGAL浓度常与炎症反应程度存在显著正相关性[2]。致动脉硬化指数(atherogenic index of plasma,AIP)是通过对三酰甘油(triglycerides,TG)与高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL-C)两者比值进行对数转换得到的参数值,临床常用于动脉硬化易感程度的评估[3]。AS病理改变基础即为脂代谢紊乱导致的血管内皮损伤以及血管慢性炎症反应,且颈动脉内膜中层厚度(intima-media thickness,IMT)增厚与AS发生风险存在正相关性,提示NGAL可能与AS发生、发展间存在密切联系,特别是NGAL和AIP的关系尚且需要进一步研究[4]。因此本研究通过观察RA患者的血清NGAL、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)以及AIP变化情况,分析其与IMT以及相关炎性因子之间的相关性,以探讨NGAL在AS中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院于2017年1月至2020年9月期间收治的192例RA患者作为研究对象,根据患者颈动脉IMT超声检查结果分为无斑块组(98例)和斑块组(94例),并以同期98例健康体检者作为对照组。3组研究对象性别、年龄等一般资料对比,差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者均签署知情同意书,本研究获得我院伦理委员会批准(K182739)。

1.2 纳入标准与排除标准 纳入标准:(1)所有患者均符合RA诊断标准[5];(2)斑块组患者经影像学和临床检查结果证实存在颈动脉粥样病变且IMT>0.9 mm,且入组前3个月内未接受过颈动脉粥样病变相关治疗;(3)无斑块组患者影像学检查结果显示IMT≤0.9 mm[6];(4)所有患者均自愿参与研究并签署知情同意书。

排除标准:(1)入组前3个月内发生过心源性脑栓塞、急性心肌梗死、脑出血等疾病者;(2)患有全身性感染、恶性肿瘤或血液系统疾病者;(3)伴有严重心、肝、肾功能异常或严重精神疾病者。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集 全面收集所有研究对象的临床资料,包括性别、年龄、病程、身高体重等信息。并统计患者入组后相关实验室检查指标:包括红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、类风湿因子、抗环瓜氨酸抗体等。

1.3.2 颈动脉IMT测量方法 采用CT彩色多普勒超声显像仪(生产厂家:飞利浦,型号:HDI 5000 sono)对所有研究对象颈部进行超声检查,设置探头频率范围为7.5～11.0 MHz。检查时患者取平卧位,将颈部位置充分暴露出来后将探头置于被检查者颈部,从上而下方向、先纵后横方向使用探头对颈动脉斑块进行仔细探查,并分别对左、右侧颈总动脉、颈内动脉以及颈动脉分叉部位的IMT值,每个位置各测定3次取平均值。

1.3.3 血浆 NGAL表达水平测定 分别于所有研究对象入组后,采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(厂家:Abcam中国)检测所有研究对象的血浆 NGAL表达水平。所有操作均按照按试剂盒操作说明进行,使用酶标仪(生产厂家:赛默飞,型号:Varioskan LUX)进行样品检测,并计算浓度。

1.3.4 实时定量PCR法检测NF-κB mRNA表达量 取所有研究对象清晨空腹静脉血5 mL,离心取血浆,将样品转移于EP管中并加入异丙醇0.5 mL,混匀并于室温条件下静置10 min。然后使用Prime Script RT reagent Kit反转录试剂盒(厂家:赛默飞)将总RNA进行反转录。NF-κB引物序列分别为正向5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′、反向5′-GGACATCTAAGGGCATCACA-3′。PCR反应条件:95 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 15 s,连续循环40次, 并于72 ℃ 条件下延伸10 min。最后均采用2-ΔΔct计算组织中NF-κB mRNA相对表达量(RQ)[7]。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 3组性别、年龄、体质指数、TC、TG对比,差异无统计学意义(P>0.05),3组病程、HDL-C、LDL-C、ESR、CRP、类风湿因子、抗环瓜氨酸抗体、颈动脉IMT对比,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,斑块组和无斑块组TG、LDL-C、CRP、ESR、类风湿因子、抗环瓜氨酸抗体、颈动脉IMT升高,HDL-C降低(P<0.001);且斑块组病程、LDL-C、ESR、CRP、抗环瓜氨酸抗体、类风湿因子以及颈动脉IMT高于无斑块组(P<0.001),HDL-C低于无斑块组(P<0.001),见表1。

表1 3组一般资料比较

2.2 3组NGAL水平、NF-κB mRNA表达量以及AIP指数比较 3组NGAL水平、NF-κB mRNA表达量以及AIP比较差异有统计学意义(P<0.05),斑块组和无斑块组患者NGAL水平、NF-κB mRNA相对表达量及AIP指数高于对照组(P<0.05),且斑块组NGAL水平、NF-κB mRNA相对表达量及AIP指数高于无斑块组(P<0.05),见表2。

表2 三组NGAL水平、NF-κB mRNA表达量以及AIP指数比较

2.3 RA患者血浆 NGAL、 NF-κB mRNA水平与其他临床指标的Pearson相关分析 Pearson相关性分析结果表明,RA患者血浆 NGAL水平与中性粒细胞 NF-κB mRNA均与TG、LDL-C、ESR、CRP、类风湿因子、抗环瓜氨酸抗体、颈动脉IMT以及AIP呈正相关(P<0.05),与HDL-C呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 RA患者血浆 NGAL、 NF-κB mRNA水平与其他临床指标的Pearson相关分析

2.4 影响IMT的多元逐步回归分析 以颈动脉IMT为因变量,以性别(男性=0,女性=1)、年龄、病程体质指数、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ESR、CRP、类风湿因子、抗环瓜氨酸抗体、NGAL、NF-κB mRNA以及AIP为自变量,采用逐步回归法筛选自变量,结果表明TG、HDL-C、LDL-C、NGAL、NF-κB、AIP、类风湿因子均为影响颈动脉IMT的独立因素(P<0.05)。见表4。

表4 响IMT的多元逐步回归分析

3 讨论

RA是一种慢性且需长期药物干预治疗的自身免疫性疾病,虽不具有直接致死性,但严重影响机体劳动能力;且近来大量研究证实RA患者发生AS、心肌梗死以及心力衰竭等相关心血管疾病的风险明显提高,大大缩短了RA患者寿命,而AS则为RA患者最重要的死因[8]。颈动脉粥样硬化是由于颈总动脉管壁发生内膜增厚、脂质沉积和斑块生成,进而导致血管管腔变窄和发生硬化的疾病;其病变过程主要包括三个阶段,发展进程依次为内皮功能发生损害、内膜厚度增加和血管内形成斑块,颈动脉粥样硬化的典型早期病理改变是颈动脉内膜中层厚度(IMT)增加,且IMT增厚程度与颈动脉粥样硬化程度存在明显正相关[9]。研究证实RA与颈动脉粥样硬化之间具有共同的发病机制,两者关系密切,特别是慢性炎症反应属于两种疾病的发病基础,均在两种疾病发生发展中发挥关键作用[10]。吴瑞荷等[11]研究结果证实促炎细胞因子如白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等不仅参与RA发生、发展过程,且对于RA心血管病具有一定预测价值。一方面,促炎因子诱导的炎症反应可以一定程度上改变RA患者HDL-C、LDL-C的结构和表达水平,进而促进AS以及其他相关心血管事件进展。另一方面,RA会导致机体氧化应激反应程度增加,进而诱导AS发生[12]。

近年来,脂肪相关因子在RA以及AS中的作用逐渐受到关注。NGAL是广泛存在于机体多个组织器官中的一种多肽分子,可参与机体免疫应答、炎症反应以及恶性肿瘤发生、发展等多种生物学过程[13]。NGAL对红细胞前体细胞分化的抑制作用以及细胞凋亡诱导作用已经被充分证实,且NGAL在多种恶性肿瘤组织中存在过度表达,有学者认为其可能属于一种潜在的致癌基因[14]。黄星等[15]研究发现在机体发生胰腺炎等炎症反应过程中,粒细胞及炎症反应受累器官会大量释放NGAL入血,且可以作为反映炎症反应程度的一种特异性标志物。中性粒细胞中NF-κB表达水平是公认的一种可炎症损伤的关键标志物,NF-κB信号通路在炎症反应过程发挥关键作用,已有研究揭示TNF-α可通过NF-κB等转录因子上调LDL-C转运量,从而进一步促进AS进展[16]。另外,当炎症反应导致下游NF-κB信号通路被激活,可进一步活化各种炎症因子,被活化的炎症因子活化又会进一步加剧淋巴细胞和中性粒细胞在炎症部位的聚集,进而促进炎症损伤[17]。本文研究结果显示,斑块组和无斑块组患者NGAL水平及NF-κB mRNA相对表达量高于健康对照组(P<0.05),且斑块组NGAL水平及NF-κB mRNA相对表达量高于无斑块组组(P<0.05)。与以往研究一致,提示RA作为一种系统性炎症性疾病,表现为机体NGAL水平及NF-κB mRNA高表达,且斑块组患者的病情较无斑块组患者严重,因此NGAL水平及NF-κB mRNA表达量高。此外,本文研究结果显示,RA患者血浆NGAL水平与中性粒细胞NF-κB mRNA均与TG、LDL-C、红细胞沉降率、CRP、类风湿因子、抗环瓜氨酸抗体、颈动脉IMT以及AIP呈显著正相关,与HDL-C呈负相关。提示炎症反应可促进RA患者AS的发生、发展,可能是NGAL通过激活NF-κB通路并诱导炎症反应发生和升级。而AIP是TG与HDL比值对数转换值,研究发现AIP与LDL颗粒大小之间存在良好相关性[18],认为AIP是可以有效反映AS危险程度的一种关键指标。本研究进一步多元逐步回归分析显示,TG、HDL-C、LDL-C、NGAL、NF-κB、AIP、类风湿因子均属于影响颈动脉IMT的独立危险因素,说明上述因素均在AS的发生、发展过程发挥重要作用。我们推测:NGAL作为一种急性时相反应蛋白,可募集炎症细胞并诱导白细胞内颗粒释放,进而发挥抗炎抑菌功效;而慢性炎症反应贯穿于RA和AS启动、形成和进展整个病理过程,NGAL可能是通过调控NF-κB信号通路参与慢性炎性反应过程,在AS病理过程中发挥作用[19]。

综上所述,RA患者血浆中NGAL水平呈显著高表达,且与AS病变程度以及AIP之间具有密切相关性,其可能是通过激活NF-κB信号通路介导炎症反应过程参与AS发生和发展。但是此次研究存在一定局限性,RA患者NGAL参与AS发生和发展的具体作用机制尚不明确,仍需深入开展基础研究进行论证。

利益相关声明:本研究无利益冲突!

作者贡献说明:杨平平、刘新正:研究实施,撰写论文;李琳瑄、宋沙伟:数据整理分析,统计学分析;冯新娜、魏立:论文修改,研究指导,资金支持。