pan-TRK蛋白在肝内胆管细胞癌中的表达及其与Ki67的相关性*

王见璋, 李炜霞, 黄金凤, 何志明

广州中医药大学顺德医院病理科(广东佛山 528333)

肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是仅次于肝细胞癌的第二大原发性肝癌,占肝脏原发肿瘤的5%～15%,近年来发病率逐渐升高[1]。ICC恶性程度高,发病隐匿,侵袭性强,5年生存率低[2]。ICC起源于二级胆管及其以上肝内胆管分支上皮细胞的恶性肿瘤。近年来有关研究显示肝祖细胞甚至成熟的肝细胞也可能发展成为ICC。ICC明显的异质性导致缺乏有效的靶向疗法。目前ICC分子靶向治疗研究包括成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、异柠檬酸脱氢酶(IDH)抑制剂、内皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、RAS/RAF/MEK/MAPK等信号通路、微小RNA靶点等[3-9]。但多数分子靶点研究尚处于临床研究实验阶段。神经营养性受体酪氨酸激酶(NTRK)是负责编码原肌球蛋白相关激酶(Trk)的基因。近年研究发现,Trk激酶与多种肿瘤的发生发展和恶化有关,Trk是肿瘤治疗的重要靶点,将靶向治疗纳入治疗方案将会提高肿瘤患者的生存率和生活质量。有研究发现ICC中存在RAS/RAF/MEK/MAPK等信号通路发生改变[9],这些通路与Trk激酶通路有部分是重叠的通路。因此,我们设想Trk通路也许在ICC中也会发生改变。本研究旨在通过检测pan-TRK蛋白在ICC中的表达情况,探讨ICC中是否存在Trk信号通路的改变,为ICC的寻找新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2017年1月至2023年1月在本院治疗的并已行病理组织学检查的肝内胆管细胞癌病例126例,根据是否存在复发转移分为复发转移组及对照组,其中复发转移组83例,对照组43例。126例男99例,女27例;年龄19～79岁,平均(64±10.7)岁,中位年龄66岁;所有病例均未行相关分子靶向治疗。研究经广州中医药大学顺德医院伦理委员会审查通过(KY2022049)。

1.2 方法 所有标本均用10%甲醛溶液固定6 h以上。后经取材、脱水、包埋、切片、HE染色、光镜下观察组织形态。免疫组化采用EnVision法,运用LUMATAS BIOSYSTEMS 全自动免疫组化检测平台,检测ICC细胞pan-TRK蛋白的表达。pan-TRK抗体(兔单克隆抗体,克隆号:EPR17341)购自英国Abcam公司,稀释比例为1∶500;Lumatas专用二抗及显色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。pan-TRK的判读标准参考文献[10],以组织内的周围神经组织为内在阳性对照,星形细胞瘤组织为外在阳性对照(图1-A)。免疫组织化学染色结果由两位有经验的临床病理医师独立阅片判断。

1.3 统计学方法 应用SPSS 26.0进行统计学处理。pan-TRK蛋白表达的阳性率比较采用Pearson2检验分析,pan-TRK蛋白与肝内胆管细胞癌相关临床病理因素Ki67指数之间的相关性分析采用Spearman相关性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pan-TRK蛋白在肝内胆管细胞癌中的表达模式 126例ICC中有8例表达pan-TRK蛋白,其中有4例表现为细胞浆均匀的中等强度至弱的棕黄色颗粒(图1-B);有3例表现为细胞核出现中等强度棕黄色颗粒(图1-C);有1例表现为散在的胞浆中等强度棕黄色颗粒(图1-D)。

2.2 pan-TRK蛋白在不同组别的肝内胆管细胞癌中表达的差异 复发转移组83例标本中有8例表达pan-TRK蛋白,阳性率为9.64%;对照组43例标本均未发现阳性病例,阳性率为0%;两组pan-TRK蛋白表达的阳性率比较,差异有统计学意义(2=4.426,P=0.035,表1)。

表1 复发转移组与对照组pan-TRK蛋白阳性率的比较 例

2.3 pan-TRK蛋白与肝内胆管细胞癌相关临床病理因素的相关性 pan-TRK蛋白表达与ICC患者性别、年龄、肿瘤病理分型、分化程度等临床病理因素的相关性,Spearman相关性分析结果显示pan-TRK蛋白与上述临床病理因素均无显著相关性(P>0.05),见表2。

表2 pan-TRK蛋白与ICC患者临床病理因素的相关性分析 例

2.4 pan-TRK蛋白与肝内胆管细胞Ki67指数的相关性 分析pan-TRK蛋白表达与ICC组织Ki67指数的相关性,pan-TRK蛋白阳性病例与阴性病例相对应的ICC组织Ki67指数主要集中在6%～50%之间,Spearman相关性分析结果显示pan-TRK蛋白与Ki67指数无显著相关性(P>0.05),表3。

表3 pan-TRK蛋白与ICC 组织Ki67指数的相关性分析 例

3 讨论

肝内胆管细胞癌(ICC)是一种高度恶性的难治性肝脏恶性肿瘤,预后较肝细胞癌差,总体5年生存率不足10%。根治性手术切除仍然是ICC患者获得长期生存率的主要治疗手段。但是,只有不到30%的患者可以获得根治性手术切除的机会。目前ICC缺乏有效的靶向疗法。对分子发病机制的进一步了解以及靶向治疗方法的发展为我们提供了改善 ICC 预后的希望。

神经营养性受体酪氨酸激酶(neurotrophic receptor tyrosine kinase,NTRK)基因是新型抗癌药拉罗替尼(larotrectinib)的靶点,包括NTRK1、NTRK2、NTRK3三位家族成员,分别位于染色体1q22、9q21、15q25不同区段,负责编码原肌球蛋白相关激酶(tropomyosin-relatedkinase,Trk)家族蛋白 TrkA、TrkB 和 TrkC[11]。当TrkA、TrkB和TrkC与其相应的配体结合后触发受体二聚体化和磷酸化,激活下游PI3K、RAS/MAPK/ERK 和PLC-γ的信号级联通路,最终调节细胞的增殖、分化、代谢、凋亡等生物学过程[12]。Trk 激酶与多种肿瘤的发生、发展密切相关。NTRK基因改变有多种形式,其中已明确与肿瘤发生密切相关的最常见形式是NTRK基因融合[13]。NTRK基因融合在多种实体瘤中出现[14-16],包括肺癌、乳腺分泌性癌、神经系统肿瘤、梭形细胞肿瘤等。与NTRK发生融合的伙伴基因众多,包括最常见的ETV6-NTRK3和TPM3-NTRK1,还有LMNA-NTRK1、PAN3-NTRK2、BCAN-NTRK1、BTBD1-NTRK3等[17]。

目前检测NTRK基因融合的方法有IHC(免疫组化)、FISH、RT-PCR、NGS等,其中pan-TRK蛋白IHC被认为是可靠、快捷的筛选方法。Hechtman等[10]收集了明确有NTRK基因融合的病例进行pan-TRK蛋白免疫组化检测,证实pan-TRK蛋白免疫组化检测对于NTRK基因融合具有很高的敏感性和特异性,同时发现pan-TRK蛋白不同表达模式提示不同的NTRK基因融合组合形式。半数的ETV6-NTRK3及全部TPM3-NTRK1表现为胞浆阳性,半数ETV6-NTRK3及全部LMNA-NTRK1表现为核及核膜染色等。其表达模式也许与相对应的基因编码蛋白的定位相关。本研究126例标本中有8例发现pan-TRK蛋白表达,总阳性率为6.35%。提示ICC发生、发展过程中可能存在NTRK基因融合及Trk信号通路的改变。不同的表达模式提示ICC中可能存在不同的NTRK基因融合。8例阳性病例中有4例表现为均匀的胞浆染色,提示这些病例有可能存在ETV6-NTRK3或TPM3-NTRK1等NTRK基因融合改变;3例表现为核染色,提示这些病例可能存在ETV6-NTRK3、LAMNA-NTRK1等融合;1例表现为胞浆散在颗粒状染色,提示可能存在其他类型的NTRK融合。但这些融合改变是否存在仍需进一步深入研究证实。

值得注意的是,本研究所有阳性病例均为复发转移组中的病例,与对照组的阳性率差异有统计学意义,提示ICC可能存在NTRK基因改变及Trk信号通路改变,并且与复发转移密切相关。我们进一步分析了pan-TRK蛋白的表达与ICC病例的性别、年龄、病理分型、肿瘤分化程度的相关性,发现pan-TRK蛋白与ICC相关临床病理因素无相关性。

Ki67是一种与增殖细胞相关的核蛋白,由MKI67基因编码,在维持细胞增殖中起关键作用。Ki67表达于细胞周期的G1、S、G2和M期,G0期不表达。Ki67与许多肿瘤的分化、转移及预后密切相关,是临床工作中运用最为广泛的重要的预后指标。我们分析pan-TRK蛋白的表达与肿瘤Ki67指数之间的关系,发现两者之间无显著的相关性,提示NTRK基因在ICC中的作用机制可能与细胞增殖的关系不大。但由于阳性病例数相对不足,研究结果还需进一步研究证实。

我们的研究发现了ICC病例中存在pan-TRK蛋白的表达,并出现不同的表达模式,且似乎与复发转移密切相关。但ICC病例中pan-TRK蛋白的阳性率低,ICC与NTRK基因及Trk信号通路改变的相关性需待更广泛的病例研究证实。此外,虽然我们的病例出现pan-TRK蛋白表达,但这些病例目前尚未进行相关NTRK基因检测,这是我们研究的不足。下一步我们将对pan-TRK阳性的ICC病例进行更加深入的研究。为进一步阐明ICC发生、发展的分子机制及寻找新的分子治疗靶点提供依据。

利益相关声明:所有作者声明无利益冲突。

作者贡献说明:王见璋负责论文设计、结果分析及论文撰写;李炜霞负责免疫组化检测; 黄金凤负责文章修改及行政支持;何志明负责切片制作。