GeneXpert MTB/RIF技术在北京市区级机构提升肺结核病原学阳性检出及利福平耐药筛查中的应用价值

赵爱兰 余琴 俞南 张爱洁 夏辉 徐伟

北京市肺结核发病率与全国相比处于较低水平,2008—2016年北京市肺结核发病率为40.00/10万～25.47/10万(全国发病率为72.95/10万～52.18/10万)[1],但要实现无结核社区及终结结核病的目标仍然需要加强结核病防治工作。朝阳区是北京市人口大区,学生、外来人口和流动人口较多,极易造成肺结核的传播[2]。北京市基层结核病检测机构主要应用的实验室检测方法仍然是涂片镜检和固体培养,涂片镜检检测敏感度低,固体培养耗时较长。2011年,世界卫生组织(WHO)推荐将GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)用于结核病的快速诊断和利福平的耐药性检测[3],在终止结核病策略中明确提出要提高新发和复发结核病患者中快速诊断方法作为初始检测方法的比例,同时要提高病原学阳性患者中耐药检测的可及性。然而,2022年全球结核病报告显示,2021年我国登记的结核病患者中仅有57%的患者将WHO推荐的快速诊断方法作为初始检测方法。目前,大多数已发表的有关GeneXpert检测方法的文献集中在其与涂片镜检、固体培养敏感度和特异度方面的比较。本研究侧重于探索在基层结核病防治机构(简称“结防机构”)中应用涂片镜检和固体培养的基础上加入GeneXpert后对活动性肺结核患者中病原学阳性检出率的影响及早期诊断利福平耐药性的应用价值。

对象和方法

一、研究对象

按照《WS 288—2017肺结核诊断》[4]标准,纳入在北京市朝阳区结核病门诊部2018年1月至2022年12月初次就诊登记的3060例肺结核可疑症状者,按照《结核病实验室检验规程》[5]留取3份痰液,分别为即时痰、夜间痰和晨痰,每份要求≥1 ml,痰液的性状有干酪痰、血痰、黏液痰和唾液痰。3份痰标本均进行抗酸染色涂片镜检,分枝杆菌固体培养使用即时痰和夜间痰,2018年1月至2021年12月对晨痰进行GeneXpert检测,2022年1—12月将每例患者的3份痰标本混合后进行GeneXpert检测。

二、实验室检测方法

1. 抗酸分枝杆菌(简称“抗酸杆菌”)涂片镜检:按照《结核病实验室检验规程》中萋-尼抗酸染色方法进行涂片镜检,3份标本中任一份发现抗酸杆菌即判定为涂片阳性。涂片镜检结果报告为阴性、实际条数、+、++、+++、++++。

2. 分枝杆菌固体培养及菌种鉴定:按照《结核病实验室检验规程》固体培养法,对每例可疑症状者的即时痰和夜间痰依次进行固体培养,将培养阳性菌株进行涂片抗酸染色,镜检后的可疑菌株接种对硝基苯甲酸(P-nitrobenzoic acid,PNB)/噻吩-2羧酸肼(thiophene-2 carboxylic hydrazine,TCH)进行初步菌种鉴定,PNB生长试验阴性,TCH生长试验阳性判断为结核分枝杆菌(MTB)。2份标本任一份培养出阳性菌株即判定为培养阳性,结果报告为阴性、实际菌落数、+、++、+++、++++,2个月没有菌落生长判定为培养阴性。

3. GeneXpert 方法:按照产品说明书进行操作,将晨痰或混合后的标本吸取1 ml加入至含有2 ml 痰消化液的前处理管中,振荡混匀15～20 s,静置15 min后吸取2 ml加入至反应盒中,上机进行检测,检测结束后,在检测系统窗口读取结果,检测结果分为阴、极低阳、低阳、中阳、高阳5个量级。

4. 比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”):按照《结核病实验室检验规程》中固体比例法药敏试验操作流程开展利福平表型药敏试验,临界浓度为40 μg/ml。每批试验均使用质控菌株H37Rv进行室内质量控制。

5. 质量控制:按照《结核病实验室检验规程》,每年定期进行痰涂片的室间和室内质量评价,均为合格。酸性罗氏培养基和药敏培养基按照要求储存于4 ℃冰箱并在有效期内使用。GeneXpert检测系统定期进行校准,定期接受国家疾病预防控制中心开展的结核病分子检测方法熟练度测试,结果均为优秀。

三、诊断原则

按照《WS 288—2017肺结核诊断》[4]标准,肺结核的诊断以病原学(包括细菌学和分子生物学)检测结果为主,结合流行病学史、临床表现、胸部影像特征、相关辅助检查及鉴别诊断等,进行综合分析后做出诊断。抗酸杆菌涂片镜检阳性、分枝杆菌固体培养阳性,经菌种鉴定为MTB或GeneXpert检测MTB阳性中任意一项结果为阳性,该患者均被诊断为病原学阳性患者。

四、统计学处理

采用Excel 2016软件进行数据整理,采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析,计数资料以“频数”和“百分率/构成比(%)”描述,组间差异的比较采用χ2检验,各年间“百分率/构成比”的趋势变化采用趋势χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。以固体培养结果为参考标准,计算GeneXpert检测的敏感度、特异度、一致率和Kappa值,其中Kappa值在0.41～0.60为一致性较低,0.61～0.80为一致性较高,0.81～1.00为高度一致性。

结 果

一、肺结核可疑症状者实验室检测结果

2018—2022年北京市朝阳区结核病门诊部共登记肺结核可疑症状者3060例,全部进行涂片镜检和固体培养检测,其中2557例(83.56%)进行了GeneXpert检测。排除18例固体培养阳性经菌种鉴定后被诊断为非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)感染的患者,29例分枝杆菌固体培养污染的患者,49例GeneXpert检测错误或无检测结果的患者,最终3种检测方法均有结果的肺结核患者共2496例(图1)。

图1 肺结核可疑症状者检测及结果分布图

二、GeneXpert检测效能分析

(一)以固体培养为参考标准分析GeneXpert的检测效能

涂片镜检、固体培养及GeneXpert结果均有效的2496例患者中,以固体培养结果为参考,GeneXpert检测的敏感度和特异度分别为79.39%(95%CI:76.20%～82.56%)和93.39%(95%CI:92.27%～94.51%),两种方法Kappa值为0.73,具有较高的一致性(表1)。涂片阳性标本中GeneXpert检测的敏感度为98.73%(95%CI:97.50%～99.96%),涂片阴性标本中的敏感度为59.34%(95%CI:53.83%～64.85%),涂阳和涂阴患者敏感度差异有统计学意义(Fisher精确概率检验,P<0.001),见表1和表2。

表1 以固体培养为参考标准分析GeneXpert MTB/RIF的检测效能

表2 以固体培养为参考标准分析不同涂片结果GeneXpert MTB/RIF的检测效能

不同年度GeneXpert检测的敏感度显示,2020年最低,为72.18%(95%CI:64.55%～79.81%),2022年最高,为90.48%(95%CI:84.20%～96.76%),各年度敏感度差异有统计学意义(χ2=11.148,P=0.025)。特异度范围为90.91%(95%CI:87.76%～94.06%)～94.82%(95%CI:92.98%～96.76%),各年度间特异度差异无统计学意义(χ2=5.960,P=0.202),见表1。

(二)GeneXpert与经菌种鉴定后的固体培养检测不一致结果分析

252例患者GeneXpert与经菌种鉴定后的固体培养结果不一致,其中GeneXpert检测阳性/培养阴性124例,GeneXpert检测阴性/培养阳性128例。GeneXpert检测阳性/培养阴性的124例患者中,极低阳性结果71例(57.26%),明显高于GeneXpert检测阳性/培养阳性患者的20.49%(101/493),差异有统计学意义(χ2=66.632,P<0.001)。128例GeneXpert检测阴性/培养阳性的患者中,121例(94.53%)固体培养结果为1～3个菌落,另7例(5.47%)为+。

(三)病原学阳性患者结果分析

1. 不同年份病原学阳性患者发现情况:2018年肺结核可疑症状者中使用GeneXpert检测的比例仅为47.54%,自2019年开始检测比例明显上升,至2022年达到98.11%。肺结核可疑症状者中,GeneXpert检测阳性率5年平均为29.89%,范围在27.37%～32.80%,见表3。

表3 肺结核可疑症状者中病原学检测情况

2. GeneXpert提高涂片阴性或涂阴培阴患者的病原学阳性情况:2018—2022年,3种方法均有有效结果的病原学阳性肺结核患者共746例,各年度3种方法的病原学阳性患者阳性检出比例见表4。3种方法对病原学阳性患者的阳性检出比例差异有统计学意义(χ2=320.000,P<0.001)。GeneXpert的阳性检出比例(82.71%)明显高于涂片镜检(46.51%),差异有统计学意义(χ2=213.691,P<0.001),与固体培养(83.24%)比较,差异无统计学意义(χ2=0.076,P=0.783)。

表4 病原学阳性患者中各检测方法阳性患者检出情况 [例(检出率,%)]

在746例病原学阳性患者中,涂片阴性而GeneXpert检测阳性的患者比例为36.86%,涂片和固体培养均为阴性但GeneXpert检测阳性患者比例为12.60%,见表4。

(四)GeneXpert检测利福平耐药及探针突变类型分析

GeneXpert检测的2496例标本中共检出MTB阳性617例,其中利福平耐药46例,耐药不确定

23例,利福平敏感548例,利福平耐药率为7.46%(46/617)。检测试剂盒中,A、B、C、D、E 5个探针突变共检测到10个基因突变型,其中3例不同时间标本检出两种突变型(无/E、ABE/AB、无/B),10个基因突变类型分别为A(6.12%,3/49)、B(6.12%,3/49)、C(2.04%,1/49)、D(8.16%,4/49)、E(63.27%,31/49)、AB(4.08%,2/49)、AD(2.04%,1/49)、DE(2.04%,1/49)、ABE(2.04%,1/49)和无探针突变(4.08%,2/49)。各突变探针的突变频率为探针E(63.27%,31/49)>联合突变(10.20%,5/49)>探针D(8.16%,4/49)>探针A(6.12%,3/49)=探针B(6.12%,3/49)>无突变(4.08%,2/49)>探针C(2.04%,1/49),探针E突变型属于优势型别,在各年度也是优势型别,见表5。

表5 GeneXpert技术检测利福平耐药情况分析

46例GeneXpert检测利福平耐药患者中仅有36例为培养阳性患者,其菌株经比例法药敏试验,显示32例耐药,4例敏感。4例比例法药敏试验敏感但GeneXpert检测耐药的3例患者为同一个探针A突变型,另1例为探针E突变型。

548例GeneXpert检测利福平敏感的患者中,447例培养阳性,其中170例患者的菌株进行了比例法药敏试验,结果显示均为敏感。

讨 论

分子生物学方法对于提高病原学阳性率具有重要作用。本研究结果显示,随着GeneXpert技术在肺结核可疑症状者中应用比例的提高,提高痰标本质量并优化GeneXpert检测对象(从挑取1份痰标本转变为混合即时痰、夜间痰和晨痰3份痰标本),活动性肺结核患者中病原学阳性比例明显提高,从2018年的45.07%提升到2022年的69.39%,与其他研究结果相似[6-8]。且进一步研究发现,通过实施GeneXpert,可以进一步检测出36.86%的涂片阴性而最终病原学为阳性的患者,以及12.60%的涂片和培养均为阴性的病原学阳性患者。由此证实GeneXpert在临床实践中的重要性,此点也与杨超等[9]的研究结果相似,同时也提示在可疑症状者中,联合使用固体培养、涂片镜检和GeneXpert 3种检测方法,结合本文中优化的标本操作对象,活动性肺结核患者病原学阳性率达到约70%(2022年为69.39%),基本是最佳数据。

在本研究中,除了2018年GeneXpert检测比例较低外,自2019年开始,GeneXpert的检测率均达到90%以上,但研究发现2019年病原学检测阳性率与2018年相比并没有明显差异,分析原因可能为2018年临床医生选取的检测患者均为高度疑似肺结核患者且选取的均为性质最好的痰标本进行GeneXpert检测,而2019年因采取尽检原则,其中不合格痰标本较多,一定程度上影响了敏感度和病原学检测阳性率。WHO总结了全球各项研究的GeneXpert总敏感度和特异度,分别为85%和98%[10]。本研究以固体培养结果为参考,GeneXpert检测的敏感度和特异度分别为79.38%(95%CI:76.20%～82.56%)和93.39%(95%CI:92.27～94.51),其中2022年敏感度最高,并且与2019—2021年相比差异明显,可能是由于2022年进行GeneXpert检测的标本为取3份标本混合后进行检测所致。本研究是一项基于常规实验室工作的回顾性分析,痰标本质量控制无法达到前瞻性研究的严格标准,这也提示在基层结防机构痰标本质量依然是影响肺结核患者病原学检测阳性率的重要因素之一。Sinshaw等[11]的研究表明,痰质量是影响GeneXpert阳性检出率的重要因素,以唾液痰为参考,干酪痰和血痰GeneXpert阳性率分别提高1.39倍和6.9倍,另一项研究也提示GeneXpert敏感度在唾液痰中明显低于脓性痰(82.5%vs. 95.8%)[12]。在基层结核病检测机构中,在无法严格控制痰标本质量的情况下,将3份标本均量混合再进行GeneXpert检测可能会提高肺结核患者的病原学检测阳性率。

在本研究中,GeneXpert和固体培养不一致主要发生于细菌载量低的患者。为了排除由于固体培养质量造成的培养假阳性问题,笔者查验原始记录,这些患者并不集中于某一时间段或时间点,也不局限于某些阳性标本同一操作时间。因此,排除了由于固体培养操作质量发生交叉污染的可能性,这些不一致的结果确实是由于标本中含菌量极低所致。

GeneXpert技术以rpoB基因为靶标检测MTB对利福平的耐药性,通过检测A～E等5个分子探针对rpoB基因81 bp核心区的覆盖情况来判断是否对利福平耐药。其与表型药敏试验检测利福平耐药性的一致性很好,仅出现4例两种方法检测不一致的患者,且主要发生在GeneXpert结果为A突变型的患者,既往研究也显示Leu511Pro的位点突变是造成临床MTB基因型与表型药敏试验结果不一致的主要原因之一[13],其他原因还包括基因突变为同义突变(即不引起表型改变);耐药水平较低,用现有利福平临界浓度无法检测到;表型药敏试验由于操作步骤较多,极个别患者可能因操作偏差引起结果不完全准确。本研究结果显示,北京市朝阳区仅GeneXpert检测阳性肺结核患者的利福平耐药率为7.46%,高于北京市昌平区2019年仅GeneXpert检测阳性肺结核患者的利福平耐药率(6.3%)[14],以及21世纪初期北京地区罗氏固体培养阳性菌株比例法药敏试验检测的利福平耐药率(5.5%)[15],可能是由于地区和人口差异,另外方法学的差异也会影响检测结果,如安燕生等[15]应用固体培养分离菌株再进行表型药敏试验,会丢掉部分培养阴性但耐药的患者,而GeneXpert可以弥补此缺陷。本研究对利福平耐药肺结核患者的耐药基因型进行进一步分析显示,本地区各年度以探针E突变型耐药为主,与林永通等[16]的研究结论一致,但与其探针突变频率的顺序有所不同,这说明不同地区所流行的菌株利福平耐药基因型略有不同。

综上所述,北京市朝阳区结核病门诊部在2018—2022年期间,GeneXpert的逐步广泛应用,不仅提高了活动性肺结核患者的病原学检测阳性率,也能及时发现利福平耐药肺结核患者。混合3份痰标本进行GeneXpert检测可能有助于提升检测阳性率。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献赵爱兰:酝酿和设计实验、实施研究、论文撰写和修改、分析和解释数据;余琴:实施研究、采集数据、统计分析;俞南和张爱洁:实施研究、采集数据;夏辉:文章修改和指导、分析和解释数据;徐伟:行政/技术/材料支持、支持性贡献和指导