HPLC 测定青钱柳叶片中槲皮素、山奈酚的含量

李俊秀，廖夏云，b，赵立春，b，梁 洁，b

（广西中医药大学，a.药学院；b.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200）

青钱柳［Cyclocarya paliurus（Bata1.）Iljinskaja］系双子叶植物纲胡桃科的青钱柳属植物。其叶片中含有黄酮、多糖、三萜皂苷和有机酸等多种活性成分［1-3］；动物及临床试验研究表明，青钱柳提取物具有降血糖［4］、降血压［5，6］、降血脂［5］、增强细胞免疫［6］、抗氧化［5，7］、防衰老［8］、抗癌［9］等多种保健功能，以青钱柳叶片制成的“保健茶”成为中国首个被美国食品药品监督管理局（Food and drug administration，FDA）认证的抗高血糖植物茶［10］。青钱柳黄酮是青钱柳叶片中含量较丰富的一类化合物，与青钱柳叶片具有的保健功能和治疗作用密切相关，因此黄酮类化合物的质量研究有助于对青钱柳叶片药材及其提取物进行质量控制。青钱柳黄酮多是槲皮素和山奈酚与糖形成的糖苷［11］。研究表明，大多数黄酮苷类化合物口服后，首先在消化道上皮细胞水解酶或肠道微生物作用下，转变成相应的黄酮苷元而被吸收，口服黄酮苷类化合物的效应成分多为黄酮苷元［12］。对青钱柳叶片黄酮类成分含量测定的研究已有很多报道［13-17］，但对黄酮类成分水解后黄酮苷元含量测定及制备工艺的研究较少。因此，本研究建立酸水解提取青钱柳叶片中2 种黄酮苷元（槲皮素和山奈酚）及其含量的HPLC 测定方法，以期为青钱柳质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（包括四元泵、在线真空脱气机G-7111A、标准自动进样器G-7129A、智能化柱温箱G-7116A、VWD 紫外检测器G-7114A、Agilent 1160 色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司）；Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；Direct-Q 超纯水制备仪；循环水式真空泵（郑州长城科技工贸有限公司）；数显电热恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；EA-240 电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］。

1.2 试药

青钱柳叶片药材产于广西壮族自治区百色市隆林县，经广西壮族自治区药用植物园白隆华研究员鉴定为青钱柳的干燥叶片。槲皮素对照品（批号100081-201610）、山奈酚对照品（批号100861-201611）均购于中国食品药品检定研究院。提取用的甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、盐酸（分析纯）均购于国药集团化学试剂有限公司，液相用的甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购于美国Fisher scientific 公司，水为Direct-Q 制的去离子水。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（体积比为35∶65）；检测波长：370 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品0.010 2 g（99.1%）于25 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配成0.4043 3 mg/mL 的槲皮素对照品贮备液；精密称取山奈酚对照品（95.5%）0.010 1 g于20 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配成0.482 3 mg/mL 的山奈酚对照品贮备液。再分别吸取槲皮素、山奈酚对照品贮备液1.00 mL，置于同一容量瓶（10 mL）中，甲醇稀释至刻度，摇匀，得到含有槲皮素（40.433 μg/mL）、山奈酚（48.228 μg/mL）的混合对照品溶液。

2.1.3 样品溶液的制备 精密称取干燥青钱柳叶片粉末（100 目筛）0.5 g，置于25 mL 具塞锥形瓶中，加入溶剂（V乙醇∶V盐酸=8∶1）10 mL，置于90 ℃恒温水浴锅中回流60 min，取出放冷至室温，过滤，滤渣用乙醇洗涤，合并滤液，乙醇定容至25 mL，摇匀。过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.4 专属性及系统适应性试验 分别吸取混合对照品溶液、样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行HPLC 测定，记录各色谱（图1）。结果表明，混合对照品溶液图谱中指标成分峰的保留时间与青钱柳叶片水解样品溶液中指标成分的保留时间一致，槲皮素和山奈酚理论塔板数均大于6 000，分离度均大于1.5 且对称因子良好，符合含量测定的要求。

图1 混合对照品（a）和样品溶液（b）的高效液相色谱

2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取槲皮素、山奈酚的混合对照品溶液2、4、8、12、16、20 μL，依次进样测定，以混合对照品溶液峰面积（y）为纵坐标、混合对照品进样量（x）为横坐标，进行线性回归计算，线性关系考察结果及标准曲线见图2。槲皮素回归方程为y=4 770.6x+17.489，相关系数R2=0.999 7；山奈酚回归方程为y=4 366.6x-13.913，相关系数R2=0.999 9。结果表明，槲皮素的进样量在0.080 8～0.808 7 μg 范围内线性关系良好；山奈酚的进样量在0.096 4～0.964 6 μg范围内线性关系良好。

图2 槲皮素（a）和山奈酚（b）的标准曲线

2.1.6 精密度考察 精密吸取混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续自动进样6 次，记录槲皮素和山奈酚的峰面积，并计算其平均值和相对标准偏差（RSD）。由表1 可知，槲皮素和山奈酚峰面积的相对标准偏差均为0.08%，表明仪器精密度良好，满足测定含量的试验要求。

表1 精密度考察结果

2.1.7 稳定性试验 按“2.1.3”项方法制备样品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h 进样测定，由表2 可知，槲皮素和山奈酚峰面积的相对标准偏差分别为0.45%、0.54%（RSD＜2.00%，n=7），表明所制备的样品溶液在24 h 内保持稳定。

表2 稳定性试验结果

2.1.8 重复性试验 精密称取相同质量（0.5 g）的青钱柳叶片粉末6 份，按“2.1.3”项方法制备样品溶液，测定2 个成分的平均含量及相对标准偏差。由表3可知，槲皮素、山奈酚含量的相对标准偏差分别为2.96%、3.01%，表明本方法的重复性良好。

表3 重复性试验结果

2.1.9 加样回收率试验 精密称取青钱柳叶片药材粉末6 份（青钱柳叶片药材粉末水解后槲皮素含量为1.658 mg/g、山奈酚含量为2.720 mg/g），每份0.25 g，分别精密加入一定量的槲皮素、山奈酚对照品贮备液，按“2.1.3”项方法制备样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表4。槲皮素、山奈酚的平均加样回收率分别为100.97%、97.25%，相对标准偏差分别为2.93%、3.29%，表明加样回收率良好。

表4 加样回收率试验结果

2.2 黄酮苷元提取及酸解条件的研究

2.2.1 提取方式和溶剂的选择 精密称取青钱柳叶片粉末0.5 g，分别以甲醇-盐酸（体积比为4∶1）、乙醇-盐酸（体积比为4∶1）为提取及水解的溶剂，料液比为1∶15（m/V，g/mL），称定重量后，分别采用超声波辅助提取法（60 min）、恒温水浴回流提取法（90 ℃，60 min）提取及水解，取出，放冷，补足减失的重量，过0.45 μm 微孔滤膜，续滤液按“2.1.1”项下色谱条件进行HPLC 测定，记录2 种黄酮苷元（槲皮素、山奈酚）的峰面积并计算含量。比较2 种方法和2 种溶剂对2 种水解黄酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量的差异，结果如表5 所示，无论使用哪种溶剂，恒温水浴回流提取的黄酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量均高于超声波辅助提取；2 种提取方法中，采用乙醇-盐酸为溶剂时得到的黄酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量较高。因此，提取方式选择恒温水浴回流提取法，溶剂选择乙醇-盐酸。

表5 提取方式和溶剂考察含量测定结果（单位：mg/g）

2.2.2 单因素优化试验 通过单因素试验考察恒温水浴回流提取法中水解液的乙醇-盐酸体积比、料液比、回流时间和水浴温度4 个因素对2 种水解黄酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量的影响，以确定各因素的参数范围，为优化工艺参数提供依据。

1）乙醇-盐酸体积比的考察。按“2.1.1”和“2.1.3”项下样品溶液制备和测定的方法，固定料液比（1∶15）、水浴温度（80 ℃）、回流时间（60 min），考察乙醇-盐酸不同体积比（4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）为溶剂时对槲皮素、山奈酚含量的影响。由图3 可知，乙醇-盐酸不同体积比对槲皮素、山奈酚含量的影响效果基本一致，随着乙醇比例的增大，槲皮素、山奈酚含量均增加，乙醇-盐酸体积比为8∶1 时达最大值，因此优化试验的乙醇-盐酸体积比设置为8∶1 左右。

图3 体积比对槲皮素、山奈酚含量的影响

2）料液比的考察。固定乙醇-盐酸体积比（8∶1）、水浴温度（80 ℃）、回流时间（60 min），考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）对槲皮素、山奈酚含量的影响。由如图4 可知，不同料液比对槲皮素、山奈酚含量的影响效果基本一致，随着提取液的量增加，槲皮素、山奈酚含量逐步增加，当料液比达1∶25 时基本稳定，因此优化试验时料液比设置为1∶25 左右。

图4 料液比对槲皮素、山奈酚含量的影响

3）回流时间的考察。固定乙醇-盐酸体积比（8∶1）、料液比（1∶25）、水浴温度（80 ℃），考察不同回流时间（30、60、90、120 min）对槲皮素、山奈酚含量的影响。由图5 可知，不同回流时间对槲皮素、山奈酚含量的影响效果基本一致，槲皮素、山奈酚含量均在30～90 min 随着回流时间的增加而增加，并在90 min达最大值，90 min 以上时含量降低，因此优化试验中回流时间设置为90 min 左右。

图5 回流时间对槲皮素、山奈酚含量的影响

4）回流温度的考察。固定乙醇-盐酸体积比（8∶1），料液比（1∶25），回流时间（60 min），考察不同水浴温度（60、70、80、90、100 ℃）对槲皮素、山奈酚含量的影响。由图6 可知，不同回流温度对槲皮素、山奈酚含量的影响效果基本一致，且随着回流温度的上升，槲皮素、山奈酚含量同步增加，90 ℃时趋于平稳，因此优化试验的回流温度设置为90 ℃左右。

图6 回流温度对槲皮素、山奈酚含量的影响

2.2.3 正交优化试验 正交优化试验设计在单因素考察结果基础上，确定因素水平的范围、恒温水浴回流提取及水解条件，分别以乙醇-盐酸体积比、料液比、回流温度、回流时间4 个因素作为考察对象，每个因素3 个水平，以槲皮素、山奈酚总含量为评价指标，采用L9（34）正交表进行工艺参数优化设计（表6），数据采用Excel软件处理［18］。

表6 正交优化试验因素及水平

根据正交试验结果和极差（表7）分析可知，各因素对槲皮素和山奈酚总含量的影响表现为A（乙醇-盐酸体积比）＞D（回流时间）＞C（回流温度）＞B（料液比），乙醇-盐酸体积比是影响槲皮素和山奈酚总含量的重要因素。以极差最小的因素B作为误差项进行方差分析，结果（表8）表明，A、C、D因素无显著差异（P＞0.05），各因素的重要性表现为FA＞FD＞FC＞FB，各因素对槲皮素和山奈酚总含量的影响表现为A（乙醇-盐酸体积比）＞D（回流时间）＞C（回流温度）＞B（料液比）。极差分析和方差分析得出优化工艺为A3B1C2D1，即以乙醇-盐酸（体积比为8∶1）为提取及水解的溶剂，每次按料液比1∶20 的量加入，90 ℃恒温水浴回流60 min。

表7 L9（34）正交试验设计及结果

表8 正交试验方差分析

2.2.4 优化参数验证试验 上述优化工艺参数不在正交试验组合之内，为了进一步检验优选工艺的可靠性，取3 份青钱柳叶片粉末，对A3B1C2D1进行验证试验，按“2.1.1”项下色谱条件进行HPLC 测定，记录2 种水解黄酮苷元（槲皮素、山奈酚）的峰面积并计算含量。结果（表9）表明，验证样品中槲皮素、山奈酚含量平均值分别为1.663 4、2.325 7 mg/g，槲皮素和山奈酚总含量平均值为3.989 1 mg/g，与正交试验最优水平组合（A3B3C2D1）值相当，说明优化比较成功。

表9 验证试验结果

2.3 样品中2 种水解黄酮苷元的含量测定

准确称取一定质量青钱柳叶片样品粉末0.5 g（100 目），平行3 份，按“2.3.1”项下方法制备样品溶液，精密吸取10 μL 进样，按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录槲皮素、山奈酚成分峰面积，以外标一点法计算样品水解后的2 种黄酮苷元（槲皮素、山奈酚）含量（n=3）。由表10 可知，槲皮素、山奈酚的平均含量分别为1.691 2、2.726 3 mg/g，相对标准偏差分别为1.76%、2.27%。

表10 样品中槲皮素、山奈酚的含量

3 讨论

采用二极管阵列检测器（DAD）在190～400 nm下分别对2 个待测成分的对照品溶液进行紫外吸收全波长扫描，显示槲皮素在255、370 nm 波长处有最大吸收，山奈酚在265、370 nm 波长处有最大吸收，故测定波长选择370 nm，在此波长下，2 种成分基线平稳且无其他成分干扰，含量测定灵敏度高。

流动相组成考察了甲醇-0.1%甲酸溶液体系、乙腈-0.1%甲酸溶液体系，发现乙腈-0.1%甲酸水为流动相时，2 种待测成分的峰形更尖锐、对称性更好，达到相同分离效果的有机相使用比例低，故流动相组成选用乙腈-0.1%甲酸水溶液体系。以该体系的不同体积分数配比进行考察试验，综合考虑目标成分获得良好的分离效果和适宜的出峰时间，最终选定流动相比例为乙腈∶0.1%甲酸=35∶65（体积比），此比例下11 min 左右可出完峰。

分别以80%甲醇、80%乙醇为溶剂，采用超声波辅助提取法和回流法提取测定青钱柳叶片中槲皮素、山奈酚含量，但此时所测得的槲皮素、山奈酚含量比较低甚至无法检出成分峰。后查阅文献发现，青钱柳黄酮多是槲皮素和山奈酚为母核与糖形成的糖苷［11］，因此，本研究采用加酸提取及水解的方法，使黄酮苷水解为苷元后再测定其相应苷元的含量。结果表明，按本试验优化的参数进行水解，色谱图中的成分峰数量明显减少，且水解前含量较多的异槲皮苷的成分峰未能检出，而槲皮素和山奈酚的色谱峰大大增高，含量均明显上升，表明黄酮苷完全水解为对应的黄酮苷元，符合大多数黄酮苷类化合物口服后在体内代谢为苷元的实际情况，也能够缓解目前黄酮苷类对照品缺乏的困境，对评估总黄酮的含量也有一定意义。

4 小结

本试验最终优化的提取水解工艺可显著提高青钱柳叶片黄酮苷元含量，建立的检测方法简便、准确、重复性好，可为青钱柳叶片药材的质量评价提供参考。