SHH与胃癌、EBV(+)胃癌患者临床病理特征和预后的相关性

刘晓梅 白光辉 郭云娣

(1苏州卫生职业技术学院,江苏 苏州 215009;2苏州市立医院普外科)

胃癌(GC)是常见的恶性肿瘤之一〔1〕;2022年中国癌症中心统计数据显示：胃癌发病率仅次于肺癌,位列所有恶性肿瘤第二位,每年新发病例(40～50)万例〔2〕,而在各种治疗方式中,虽然化疗和手术提供了很大的帮助,但对于晚期胃癌疗效仍不尽如人意〔1〕。EB病毒(EBV)阳性〔EBV(+)〕GC是一种继发于EBV感染的胃黏膜上皮细胞〔3〕克隆性生长的胃腺癌,这种GC类型具有独特的信号通路,其相关的分子特征可以揭示药物治疗〔4〕的潜在靶点。SHH是编码分泌型糖蛋白配体hedgehog(HH)蛋白的基因,主要在胚胎期参与细胞生长和分化,特别是在维持正常胃肠道生长和分化中发挥作用〔5〕。近年来,SHH在正常胃肠道及胃肠道恶性肿瘤中的表达也被报道〔5～8〕,但在EBV(+)GC中研究较少。本实验探索SHH蛋白质在EBV(-)GC、 EBV(+)GC及癌旁正常组织中的表达模式及其与临床病理参数、预后的关系。

1 材料与方法

1.1材料 收集苏州市立医院2000年1月至2010年12月住院患者手术切除GC病理蜡块标本486例,由于较薄组织在切片时缺失,本组有效病例为375例〔检测出EBV(+)GC 10例〕,之后另外收集EBV(+)GC 12例;邻近正常组织(距肿瘤5 cm以上)200例。随访时间2～63个月。患者术前均未进行放、化疗,所有标本经两位病理专家阅片确诊。患者无其他恶性肿瘤及心、肝、肾等重要器官严重损伤。排除临床资料不完整者。本研究375例GC中年龄中位数为61.0岁。

1.2试剂 免疫组化：SHH抗体购自Abcam公司(EP1190Y,ab53281),为兔抗人多克隆抗体,用迈新公司抗体稀释液以1∶200比例稀释。高压锅PH为6.0的柠檬酸盐液修复。采用Envision免疫组化法,以柠檬酸盐缓冲液代替SHH为阴性对照。EB病毒编码的小RNA(EBERs)原位杂交检测试剂盒购于福建泰普生物科学有限公司,实验按照说明书进行操作。

1.3组织芯片的构建 常规石蜡包埋蜡块4 μm厚连续切片,常规苏木素-伊红(HE)染色后,用显微镜标记出对应蜡块上的肿瘤组织或正常组织。自制10×16芯片蜡块7个,每个蜡块75例×2点;2个癌旁正常组织(距GC组织至少5 cm处)蜡块8×10(每个蜡块50例×2点),另外制作1个EBV(+)GC 单独的芯片蜡块〔8×5;375例GC芯片中筛选出的10例,再加上后续临床确诊EBV(+)GC 12例;3例胃正常组织和3例鼻咽癌组织〕,芯点直径为1.6 ml。蜡块(空位为芯片定位处)。SHH蛋白染色GC有效组织共375例,EBERs原位杂交阳性组织共22例。芯片技术的专利号为：200920350099.2。

1.4原位杂交、免疫组化染色及结果判定 EBV原位杂交EBERs染色结果判断标准：仅细胞核棕褐色为阳性,细胞质和细胞膜在核分裂时可以有阳性着色,但视为阴性。SHH阳性表达于肿瘤细胞质,呈现棕黄色颗粒为阳性信号。结果判定方法按照文献〔1〕方法：将各组织的染色强度和比例相加评分量化为阴性(0分)、弱阳性(1～2分)、中阳性(3～4分)、强阳性(5～6分)。但本研究只采用了两种分类,将染色归为低表达(4分及以下),过表达(5～6分)。

1.5统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行χ2检验、Spearman等级相关分析、Kaplan-Meier分析。

2 结 果

2.1SHH蛋白在 GC及癌旁正常组织中的表达 SHH在 GC组织中阳性表达于细胞质,其表达率为71.2%(267/375);在癌旁正常组织中亦表达于细胞质,其阳性率为61.5%(123/200);两组间差异有统计学意义(χ2=20.012,P=0.000),SHH蛋白明显高表达于GC组织中。见图1。

2.2SHH阳性表达与GC临床病理参数的关系 375例GC中,SHH阳性表达与年龄、性别、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、Lauren分型、血管侵犯、TNM分期均无关(P>0.05);只与肿瘤淋巴结转移密切相关(P<0.05)。见表1。

表1 SHH阳性表达与GC及EBV(+)GC临床病理参数关系(n)

2.3SHH与EBV(+)GC相关性 SHH蛋白表达与EBV(+)GC原位杂交(图2)的Spearman等级相关性分析显示,22例EBV(+)GC中SHH蛋白表达21例,SHH蛋白表达与EBV(+)GC呈负相关(r=-0.129,P=0.012)。

2.4SHH与EBV(+)GC 生存分析 Kaplan-Meier生存分析：EBV(+)GC随访5例,随访6～45个月、EBV(-)GC随访151例,随访2～63个月(χ2=0.451,P=0.502); SHH表达阳性者随访109例,随访2～61个月;SHH表达阴性者随访40例,随访3～63个月(χ2=0.634,P=0.426),提示2个检测指标均与患者生存时间无关。见图3。

图3 SHH与EBV表达GC患者生存曲线

3 讨 论

哺乳动物中存在3个Hedgehog的同源基因：SHH、IHH和DHH,分别编码SHH、IHH和DHH蛋白〔9〕。SHH蛋白作为一种配体在信号通路中发挥关键作用,以帮助胚胎发育、正常成人组织的维持、修复和肿瘤的发生,并在包括胃肠道在内的多种身体器官中均有表达〔10〕。本研究结果提示,SHH作为一种致癌蛋白可能在胃癌早期的发生过程中起关键作用,与Zhai等〔11〕的报道相同,而且SHH信号通路在成人组织中持续或异常的激活可促进癌症进展〔12〕。在一系列恶性肿瘤中,包括皮肤、乳腺、肺、脑、前列腺和消化道〔12～15〕等器官中,HH通路的调控异常已被报道并与此类患者的生存期缩短有关,认为SHH可能是GC有用的生物标志物或治疗靶点。Akhtar等〔5〕研究结果认为,SHH与患者生存相关,与本研究结果相一致,本研究结果提示,EBV(+)GC独特的信号通路与EBV(-)GC不同,其相关的分子特征有可能揭示药物治疗的潜在靶点。

尽管90%以上的成年人为EBV携带者,但EBV感染极少见于非肿瘤胃黏膜上皮细胞,而几乎所有肿瘤细胞中可检测到单克隆EBV〔16〕,有研究〔16〕,胃癌中EBV感染率为3.7%(18/486),并同时存在于淋巴结转移癌中,推测EBV感染建立于胃癌发生的早期阶段,这些研究结果与随后的〔17～20〕的研究相一致。随着对胃癌研究的不断深入,世界卫生组织(WHO)2019年消化系统肿瘤提出了EBV(+)GC这一具有特定分子特征和致癌机制的GC亚型。而EBV感染是否与SHH信号通路相关,目前尚未见明确的研究结果,但我们知道鼻咽癌与EBV感染有因果关系并表现出频繁的HH通路调控异常〔11〕,在正常鼻咽鳞状上皮中HH通路成分低表达,而在鼻咽癌(NPC)中大量表达SHH。结合本研究结果,提示SHH的异常表达可能是HH通路活性异常的结果。许多机制导致HH通路失调,Port等〔19〕研究发现,EBV对SHH的诱导可能导致通路失调,SHH过表达是否是GC的HH通路失调的唯一原因尚不清楚,尚需大量的基础实验来加以证明,但未来的研究将揭示GC发病机制中这些因素与肿瘤发展途径之间的潜在相互作用及EBV在这一现象中所起的作用;这些发现可提示SHH通路可能是GC及EBV(+)GC潜在的新治疗靶点。

综上,SHH蛋白高表达于胃癌组织中并与其淋巴结转移密切相关,而与其他临床病理参数及患者预后无关;与EBV(+)GC呈负相关。虽然不排除这些相关性结果的偏差及实验方法的不同或标本量不够等因素,但这些结果仍可以提示使用特定抑制剂阻断SHH通路可能是很有潜力的治疗靶点。