抗凝血材料的研究进展及其表面肝素化设计

刘望龙

（丰凯利医疗器械〈上海〉有限公司，上海，201318）

0 引言

抗凝血生物材料作为生物材料的重要组成部分，已被广泛应用于与人类血液和组织相接触的医疗器械上，如体外循环系统、心脏起搏器、人工血管等［1］。以特定的工艺将抗凝血材料涂敷于基体材料表面，使其具有良好的抗凝血功能和血液相容性，已被证实可有效降低血液接触类医疗器械表面血栓形成的风险。

1 抗凝血材料的研究进展

抗凝血材料也叫血液相容性材料，系材料在与血液直接接触时不会引起血液凝固，同时可以正常发挥其性能的一类生物材料。目前，已有研究证实具有抗凝血功能的材料主要包括无机材料、两性离子聚合物材料和生物活性材料。

1.1 无机材料

类金刚石（DLC）是一种由碳元素构成，在物理性能上和钻石类似，微观结构由石墨原子组成的物质。DLC涂层是一种非晶态薄膜，具有许多优点，包括超高强度、低摩擦系数、化学稳定性和高导热性，以及优良的生物相容性和血液相容性。在室温条件下，DLC薄膜（或涂层）可以在较温和的环境下利用一定技术手段使石墨小分子沉积在基材上形成，而且绝大部分材料表面均可制备DLC薄膜［2］。与碳钛合金、氧化钛、聚晶金刚石和膨胀聚四氟乙烯等其他常用于制备医疗器械的材料相比，DLC涂层表面优良的疏水性和光滑性使血小板黏附性最低，血液相容性最优［3］。不过，DLC涂层是一种超硬涂层，适用于金属等较硬材料表面，当材料使用时发生弯折或形变，涂层存在出现开裂的风险，故不适合高分子弹性材料或有机塑料材料表面。

1.2 两性离子聚合物材料

磷酸胆碱（PC）是一种类似于生物膜表面结构的磷脂类聚合物，也是构成血红细胞外膜的主要成分，具有优异的血液相容性和稳定性。2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（MPC）具有磷酰胆碱基团，MPC聚合得到的两性离子聚合物已被证实具有良好的血液相容性，其抗凝作用主要通过增加聚合物中游离水的量来形成“水合层”以减少蛋白质吸附，从而完全抑制血小板黏附和激活，即使聚合物与没有抗凝剂的人血接触时也能够保持血液相容性和抗蛋白质吸附的特性［4］。基于此，在基底材料表面制备一层MPC聚合物薄膜可以显著增强材料的抗凝血性能［5］。

1.3 生物活性材料

肝素是一种天然抗凝血药物，最早被用来制备具有抗凝血作用的生物活性材料。医学研究表明，血浆中加入肝素成分可以有效抑制促凝血蛋白酶Xa因子和凝血酶的活性以阻止纤维蛋白凝块的形成，从而达到抗凝血的功效［6，7］。在材料表面形成一层肝素化涂层可以防止血小板黏附并降低其活性，从而提高材料的血液相容性。传统的肝素涂层一般采用物理涂覆的方法附着在材料表面。物理涂覆的通常做法是通过静电自组装作用先在材料表面形成一层聚乙烯亚胺薄膜，然后利用离子相互作用使肝素吸附在表面［8］。但这种方法制备的抗凝涂层稳定性较差，肝素易脱落，因此在很大程度上限制了使用时间。

近些年来，采用化学接枝方法的研究越来越多。化学接枝采用等离子处理、共价键结合等方法使材料表面形成含肝素成分的聚合物涂层。这种方法制备的抗凝涂层牢固度很好，其抗凝血特性可保持长达几个月甚至更久［9，10］。因此，通过共价键固定的肝素涂层是一个解决材料抗凝的好方法，但这项技术所涉及的化学过程和操作比较复杂［11］。基于此，本文重点介绍了一种材料表面肝素化设计的方案，通过表面接触角测试追踪实验每个步骤以保证过程的准确性，通过血小板吸附实验和体外PTT测试证实表面肝素化的材料具有良好的抗凝血特性。

2 一种表面肝素化抗凝血材料的制备方法

聚醚酰胺嵌段共聚物（pebax）具有良好的力学性能、化学稳定性和热稳定性，是一种已被广泛应用于微创介入领域的生物高分子材料。以pebax材料为例，在其表面制备“肝素化涂层”，可实现pebax材料导管抗凝血的性能。

2.1 实验部分

2.1.1 材料表面氨基化

配制3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）5%（V/V %）的溶液，溶剂96%乙醇/水，同时加入2～3滴乙酸做保护剂。

把pebax导管清洗干净后真空干燥，使用等离子设备（O2氛围，60W，300s）将导管活化，然后浸没到APTMS溶液中，在37℃水浴条件下反应2h，过程通过测试材料表面接触角来判断表面活化和氨基化的效果。

2.1.2 接枝聚N-羟基琥珀酰亚胺甲基丙烯酸酯（PNHSMA）

配制PNHSMA溶液80mg/mL，采用三氟乙醇做溶剂，加入7%（V/V %）三乙胺做催化剂。

把第一步得到的导管加入溶液中，室温下反应24h。反应结束后，依次用乙醇、去离子水清洗干净。

2.1.3 接枝聚乙烯亚胺（PEI）

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配制PEI（MW 70000）溶液10mg/mL，采用三氟乙醇做溶剂，加入1%（V/V %）三乙胺做催化剂。

把导管浸泡在溶液中，室温下反应24h。依次用乙醇、去离子水清洗干净。

2.1.4 pebax材料表面肝素化

取一定量吗啉乙磺酸（MES，分散剂），配置其缓冲液11mg/mL；加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（磺基-NHS，催化剂），1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC-HCl，活化剂）和肝素钠盐，三者摩尔比是1：1：2.5；把pebax导管浸泡在溶液中，室温下反应24 h；反应结束后，用去离子水充分清洗，以确保将物理吸附在材料表面的肝素及其他成分清洗干净。真空干燥，待测。

2.2 测试结果与分析

2.2.1 表面接触角测试

在实验过程中，涉及多种基团的化合物或聚合物的接枝，材料表面的接触角也会发生变化。测试结果见表1。

表1 导管表面的水接触角

利用静态接触角测量追踪实验过程的每个步骤。pebax导管表面最初的水接触角是83°，经过等离子活化处理后，接触角降至47°，这说明材料表面形成了一层亲水的羟基基团。当接枝完APTMS时，材料又形成一层氨基化表面，接触角升高至80°。继续接枝一层PNHSMA聚合物，接触角变化不大。当接枝完偏亲水性的PEI，接触角降低至64°。继续接枝亲水性的肝素大分子，接触角降低至26°，这与之前一些研究报告的结果相符合［12］。

血小板具有与其他物质表面黏着的特性。当材料表面与血液相接触时，会逐渐吸附血小板，引起血小板的聚集。这一变化是导致血栓形成的重要原因。因此，材料表面抗血小板黏附的性能是衡量材料抗凝血性能的一个重要指标［13］。

把导管加入血小板血浆中，37℃条件下浸泡1h，结束后使用PBS缓冲溶液（pH 7.4）洗涤3次，再在戊二醛溶液（2.5%）中浸泡30 min。依次在不同浓度（50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）的乙醇溶液中各浸泡30 min，以逐级脱水。干燥后喷金，使用扫描电镜观察材料表面血小板的黏附情况。为方便对比，同时加一组无涂层的pebax导管作为空白样。实验结果如图1。

图1 pebax材料表面SEM扫描图

经过l小时的血小板吸附实验可以观察到，空白导管表面有大量血小板黏附，而且呈现出聚集趋势。与此同时，带肝素涂层的材料表面仅仅有少量的血小板吸附，而且很分散。由此可见，采用多步接枝使材料表面肝素化的方法，可显著提高材料的抗凝血性能。

2.2.3 体外抗凝血测试

当材料表面与血液接触时可激活内源性凝血通路，引起血浆中与凝血酶相关的抗凝血酶Ⅲ复合物（TAT）和β -血小板球蛋白水平的提高，因此，通过测定这些指标，可以判断凝血通路被激活的程度。PTT是测定内源性凝血通路激活常用的方法［14］，可通过凝血分析仪测定与医疗器械/材料接触后血浆的部分凝血活酶时间。

采集新鲜的抗凝兔全血（采集4h内），离心获得上层血浆，颠倒均匀后置于冰上保存备用。使用不与任何材料接触的兔全血作为空白对照。把制备的新鲜兔血浆加入试管A和试管B中分装，取不带涂层的导管和有肝素涂层的导管分别浸没在试管A和试管B中，将所有试管轻轻混匀后放在旋转培养器上，在37± 1C条件下，动态接触60min。每管血浆进行两次重复测试，变异系数≤15%，否则重新进行试验。取3次结果的平均值为最终结果。温育结束后将试管中的血浆转移至预先冰浴的新试管中。使用全自动凝血分析仪分别测定各试管血浆的PTT值。测试结果见表2。

表2 体外凝血时间测试

与空白对照组不与任何材料接触的血浆相比，不带涂层的样品的PTT值为30.2s，变化不大，但带肝素涂层样品的PTT值升高至156.2s，这说明肝素涂层对凝血有显著的延时作用。

通过体外凝血时间测试，进一步证实了利用接枝手段使材料表面肝素化的方法可以有效提高材料的血液相容性，减少血栓的形成。

3 小结

抗凝血材料具有较高的技术门槛，由于国内医疗器械领域起步晚、产品研发落后，在过去很长一段时间内，抗凝血材料的应用严重依赖于国外厂家的技术服务。但近些年来，随着我国科学技术的不断进步和创新，国内在生物医用高分子材料，特别是抗凝血材料研究方面取得了很多成果。

2020年，四川大学国家生物医学材料工程研究中心开发了肝素长效抗凝涂层技术，打破了国外技术壁垒，成功应用在 ECMO 系统上，具有良好的组织相容性，能降低血液破坏、减少炎症反应及延缓血栓形成。2022年，天津大学李双阳团队开发的两性离子水凝胶材料，有着比天然血管内皮表面更佳的超亲水性和超润滑性，再加上独特的抗蛋白质吸附功能，成为制备人工血管的理想材料。

当然，每一种抗凝血材料都有自己的优势和劣势，目前还没有哪种生物材料表面具有天然血管壁内皮细胞所特有的抗凝血和止血功能。随着材料科学、医学、生物学等学科的发展与相互渗透，抗凝血材料相关技术会不断得到开发与改进，并更多、更有效地应用在医疗领域，造福更多的心血管疾病患者。