晋东南猪源沙门氏菌血清型调查与药敏试验

申子平，倪海星※，陈星，赵慧敏，原慧斌

（1.长治职业技术学院，山西 长治 046000；2.四川恒通动物制药有限公司，四川 内江 641000）

沙门氏菌为猪体内的常在菌，当外界环境突变或猪体免疫力降低时就会引起发病[1]。大多养猪场养殖密度较大，造成了近几年晋东南地区养猪场猪沙门氏菌病的频繁发生。许多养殖场在不知沙门氏菌血清型的情况下，乱用、滥用抗菌药物，造成沙门氏菌耐药性增强，防治效果不理想[2]。针对这种情况，试验先确定晋东南地区猪沙门氏菌的血清型，然后找到治疗猪沙门氏菌病的敏感药物，为该地区猪沙门氏菌病的防治提供参考。

1 材料

1.1 病料

在晋东南地区陵川、长治、长子、黎城、沁县、襄垣、平顺、武乡、沁源和壶关等10 多个县的养猪场采集疑似沙门氏菌病的样品63 份，即用灭菌棉签从病猪肛门处的直肠内挑取大约1 g 的粪便，置于有缓冲蛋白胨水的离心管内。离心管放置于有冰袋的保温箱内，密闭保存。

1.2 试剂

显色培养基由北京陆桥技术股份有限公司生产；缓冲蛋白胨水、营养琼脂、亚硒酸盐胱氨酸培养基由环凯微生物科技有限责任公司生产；革兰氏染色液由常德比克曼生物科技有限公司生产；沙门氏菌属定型血清由天润生物（宁波）药业有限公司生产；药敏纸片、生化鉴定管由温州布康泰生物科技有限公司生产。

1.3 仪器

恒温培养箱由景迈仪器有限公司生产；微量移液器由力辰仪器科技公司生产；高压灭菌锅由杭州瑞诚仪器有限公司生产；电子天平由力辰（上海）仪器有限责任公司生产。

2 方法

2.1 病菌的分离、培养

将样品拭子置于亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，在培养箱中37℃培养20～24 h；将增菌液混匀后，用移液器吸取100 μL，置于沙门氏菌显色培养基上，涂匀，37 ℃培养20～24 h；用接种棒挑取显色为紫色的单菌落于营养琼脂上，37 ℃培养20～24 h；纯化后，保存于4 ℃冰箱中，备用。

2.2 病菌生化试验

挑取分离纯化后的菌落，按照生化鉴定的操作流程进行生化反应试验[3]。生化试验项目有18 个：三糖铁、甘露醇、蔗糖、氰化钾、鸟氨酸脱羧酶、麦芽糖、吲哚、尿素、丙二酸盐、山梨醇、鼠李糖、肌醇、脲酶、酚红、ONPG、靛基质试验、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖等。

2.3 病菌血清型测定

2.3.1 病菌的O 抗原测定

对生化反应后，确定是沙门氏菌的菌株进行血清型鉴定。取一无菌载玻片，用接种针挑取纯化好的沙门氏菌单个菌落于玻片的左右两个区域，滴加1 滴多价诊断血清于其中的一侧沙门氏菌上，另一侧沙门氏菌滴加1 滴生理盐水，作为对照[4]。混匀后，静置1 min，观察结果。

有凝集反应者，再用单因子诊断血清重复以上的操作，如果有凝集便可确定该菌株的O 抗原为此单因子抗原。

2.3.2 病菌的H 抗原测定

操作步骤同2.3.1。

根据生化反应与病菌O 抗原测定与H 抗原测定结果，确定测试株的血清型。

2.4 分离菌致病性试验

选取18～20 g 的小白鼠来测定分离菌的致病性。试验组和对照组小白鼠的分配用随机方法，每组3 只。试验组每个组的小白鼠接种1 个测试菌株。测试前，将纯化后的测试菌株接种至马丁肉汤，37 ℃下培养20 h。试验组每只小白鼠采取腹腔接种的方式注射0.2 mL 菌液（5×108CFU/mL）；对照组小白鼠每只注射0.2 mL 马丁液体培养基。饲养并观察7 d，记录小白鼠状态，及时对死亡小白鼠解剖，7 d 后全部剖杀。无菌采取脾脏或肝脏，再次进行细菌的分离和镜检。

2.5 分离菌药敏试验

试验用纸片扩散法进行[5]。有17 种药物用于测定：大观霉素、阿莫西林/克拉维酸、黏杆菌素、复方新诺明、多西环素、诺氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松、氨苄西林、卡那霉素、磺胺异恶唑、头孢噻呋、氧氟沙星和四环素等。

3 结果与分析

3.1 病菌分离、培养结果

病菌在亚硒酸盐胱氨酸培养基上进行培养后，试管增菌液呈现红色浑浊状；红色浑浊增菌液在显色培养基培养后，呈紫红色的表面平滑单菌落；在营养琼脂上培养后，呈圆形的无色大菌落。通过上述分离纯化后，63 份病料中有43 株疑似为沙门氏菌。

用疑似菌涂片、染色后镜检，可见细菌为两端钝圆、没有荚膜、也没有芽孢的革兰氏阴性菌。

3.2 病菌生化试验结果

对43 株疑似沙门氏菌的菌株进行了生化试验，结果见表1。

表1 43 株疑似菌生化鉴定结果

由表1 可知，三糖铁、甘露醇、鸟氨酸脱羧酶、鼠李糖和葡萄糖等几个生化试验项目的阳性反应比例为100%；而在蔗糖、氰化钾、麦芽糖、吲哚、山梨醇、丙二酸盐、肌醇和脲酶几个项目的阳性反应比例为0。因此，43 株疑似菌符合沙门氏菌的特性。

3.3 分离菌血清型鉴定结果

从表2 可知，43 株病菌有41 株确定了抗原类型，有2 株未能确定抗原类型。

表2 43 株分离菌抗原鉴定结果

41 株分离菌的抗原血清型属B、C1 和E1 群。其中鼠伤寒沙门氏菌有18 株，占到了41.86 %；其次是里森沙门氏菌，占25.58 %；伦敦沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌各占9.3%；姆班达卡和妞兰沙门氏菌各占4.65 %。

3.4 致病性测定结果

给小鼠接种后进行观察，对照组7 d 内没有异常表现，7 d 后剖检也没发现病理变化；其余43 个试验组的小白鼠均在72 h 内表现出沙门氏菌病的临床症状或发生死亡情况。症状有被毛散乱、食欲不振、精神萎靡、呼吸困难、粪软有黏液。解剖病变以肝脏和脾脏病变为主，肝、脾肿大，肝表面有明显的坏死灶；淋巴结肿大；肠内充满气体和液体，肠黏膜肿胀充血。

从剖检鼠的脾脏、肝脏中均分离到了沙门氏菌。表明试验分离到的43 株病菌，无论有没有定型都有较强致病性。

3.5 药敏试验结果

由表3 可见，本次试验分离到的沙门氏菌对黏杆菌素敏感性最强（敏感率95.35 %），其次是头孢噻呋、氧氟沙星和头孢曲松（敏感率93.02 %）；中敏感的药物是诺氟沙星（敏感率72.09 %）；而对阿莫西林/克拉维酸耐药性最强，其次是四环素、大观霉素和磺胺异恶唑。

表3 43 株细菌药敏试验结果

4 讨论

4.1 细菌血清型

试验除了2 株未定型菌株外，鉴定出的血清型有鼠伤寒沙门氏菌、里森沙门氏菌、德尔卑、伦敦沙门氏菌、姆班达卡和妞兰沙门氏菌。可见，在晋东南地区流行的沙门氏菌有多种血清型。在流行的血清型中，鼠伤寒和里森沙门氏菌为优势血清型，占到了该试验中定型菌株的70.73 %，是该地区的主要血清型。该地区养殖场在预防猪沙门氏菌时，应以鼠伤寒沙门氏菌和里森沙门氏菌为主要对象。

4.2 细菌致病性

在细菌致病性试验中，43 株沙门氏菌均引起小白鼠的临床症状，或发生器官的病理变化，或引起死亡。所以，在晋东南地区流行的猪源沙门氏菌毒力较大，有较强的致病性，应该引起养殖人员的重视，以防沙门氏菌病的发生。

4.3 细菌耐药性

试验发现，晋东南地区猪源沙门氏菌对黏杆菌素敏感性最高，其次是头孢噻呋、氧氟沙星和头孢曲松，所以，在晋东南地区治疗猪沙门氏菌病时，应首先选用这几种药物；少用诺氟沙星；禁用四环素、磺胺异恶唑、大观霉素等药物。

我国生猪生产密度大，沙门氏菌传染性又较强，很容易造成猪群感染，控制不及时还会造成人的感染，后果严重[6]。在晋东南地区，近几年猪沙门氏菌病频繁发生，这主要是沙门氏菌有致病性的血清型较多，养殖人员在没有弄清流行血清型的情况下就进行预防，效果很差[7]。本次试验找出了该地区猪场流行的沙门氏菌血清型，供养殖场在预防该病时参考，并建议猪场用本场流行的血清型自制疫苗预防。试验也找出了该地区流行的猪源沙门氏菌的敏感药物，供猪场在治疗猪沙门氏菌病时参考。