桑叶水提工艺优化及水提物的体外抑菌试验

江素娟，李万军,2，张明军，彭涛，柳亦松※

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省耒阳市畜牧水产事务中心，湖南 耒阳 421800）

1 前言

桑叶（Morus folium）是桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶。桑为落叶乔木或灌木，其抗逆性强，种植范围广泛，是目前最高产的叶用经济植物之一[1]。桑叶富含黄酮类、多糖、多酚和生物碱等多种活性成分[2]，这些活性物质具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、降血脂等功能[3-6]。桑叶广泛应用于制药、食品、饲料、化妆品等行业[1]。有研究结果表明在罗曼灰蛋鸡饲料中添加桑叶提取物，改善了肠道组织形态，提高了抗氧化能力及免疫功能，一定程度上提升了蛋品质[7]。

目前桑叶的活性成分提取方法主要有回流提取法、微波辅助提取法和超声辅助提取法等。朱亚伟[8]等采用响应面优化酶解-微波辅助法从桑叶中提取桑叶多糖，在最优提取工艺下桑叶多糖的提取率为15.23%。苏伟[9]等采用超声辅助提取桑叶总黄酮，在最佳工艺条件下，桑叶总黄酮得率为2.7%，经AB-8 大孔树脂洗脱纯化后，总黄酮的纯度达33.8%。Vichasilp C[10]等采用超声波辅助提取法提取桑叶中的脱氧野尻霉素（DeoxyNoJirimycin,DNJ）并通过响应面法进一步优化，得到高提取效率及生产率的DNJ 粉末。

为了提高桑叶水提物的产量，本试验采用单因子试验和正交试验法研究桑叶的回流提取最佳工艺；为了探索桑叶水提物改善动物生产性能的初步机理，本试验采用纸片法研究桑叶水提物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、农杆菌、枯草芽孢杆菌的抑制能力，以便为桑叶的综合开发及利用提供试验依据。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验药材

本试验桑叶购买于湖北等药材市场。

2.1.2 试验试剂

植物类黄酮含量检测试剂盒（AKPL015C）购自北京盒子生工科技有限公司，LB 肉汤（028324）、LB琼脂（028334）培养基均购自环凯生物科技有限公司，细菌培养皿（BS-90-D）购自Biosharp。

2.1.3 试验菌株

试验中用到的细菌由本院实验室提供，包括：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、农杆菌、枯草芽孢杆菌。

2.1.4 试验仪器

高速离心机（5427R，德国EPPendorf 公司）、万分之一电子分析天平（ME204E,METTLER TOLEDO）、旋转蒸发器（RE-5203，上海亚荣生化仪器厂）、循环水真空泵（SHZ-Ⅲ，上海亚荣生化仪器厂）、紫外可见分光光度计（UV2400，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、多功能酶标仪（Infinnte E Plex，天津泰斯特仪器有限公司），超纯水制备仪（AWT-TOC-20L，四川优普越纯科技有限公司）、恒温培养震荡箱（ZWY-2102C，上海智城分析仪器制造有限公司）等。

2.2 方法

2.2.1 单因子试验

干燥桑叶过40 目筛，称取过筛后的样品50g，在其他因素不变的情况下，分别考察提取次数（1～5 次）、提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、溶剂倍数（10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1 mL/g）对桑叶水提浸膏得率的影响，浸膏得率取3 次试验的平均值。

2.2.2 正交试验

依据上述优化得到的单因子试验结果，选取提取次数、提取时间、溶剂倍数3 个因素为自变量，以浸膏得率与浸膏中总黄酮含量的综合评分为考察指标（满分100 分），采用L9（33）正交试验分析确定桑叶水提物的最优工艺。正交试验设计见表1。

表1 正交试验设计

综合评分=（浸膏得率/正交试验中浸膏得率最大值）×50＋（总黄酮含量/正交试验中总黄酮含量最大值）×50

2.2.3 总黄酮标准曲线的建立

将10 mg/mL 芦丁标准液稀释至0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL 即为标准稀释液。在510 nm处测定其吸光度，得到总黄酮标准曲线回归方程y= 3.3297x - 0.041，其中y 为溶液吸光值，x 为质量浓度，线性相关系数R2= 0.9986，表明当吸光值在0.04～1.311 时，标准曲线方程线性良好，适用于桑叶水提物总黄酮含量的测定。

总黄酮含量（mg/g）= x ×V提/ W

式中：x 为计算出的浓度（mg/mL）；V提为提取液体积（mL）；W 为样品质量（g）。

2.2.4 桑叶水提浸膏得率

水提浸膏得率（%）= m2/ m1× 100%

式中：m2为提取得到桑叶水提物的质量（g）；m1为提取桑叶水提物用的原料的质量（g）。

2.2.5 桑叶水提物总黄酮含量测定

称取100 mg 桑叶水提物，加入1 mL 试剂盒中的提取液，超声提取至完全溶解（60 ℃、功率300W，超声5 s，间歇8 s，总时间30 min）；加速度12000 g 常温离心10 min 后，取上清液为待测样本。后续按试剂盒说明步骤操作，测得吸光度代入黄酮标准曲线可得样本总黄酮含量。

2.2.6 培养基的制备

固体培养基：称取35.0 g 培养基干粉，加入1 L蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min，每个无菌平皿中倒入约15 mL 的培养基，冷却后备用。

液体培养基：称取20.0 g 培养基干粉，加入1 L蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min，分装于离心管中备用。

2.2.7 供试菌悬液的制备

将供试菌种复苏后接种于普通琼脂平板，置于37℃恒温培养震荡箱中培养24 h。分别用接种环灭菌挑取各个菌落菌于LB 肉汤培养管中，再继续37℃培养24 h，制备约1×108～5 ×108CFU/mL 的菌悬液用于抑菌试验。

2.2.8 抑菌纸片的制备

用打孔机将普通定性滤纸制成直径为6 mm 圆形纸片，经121 ℃高压灭菌20 min，60 ℃干燥备用。

2.2.9 桑叶水取物的制备

采用2.2.2 中得出的最优提取工艺进行提取物的制备。干燥的桑叶药材粉碎后过筛，取过筛后的样品50 g 加入圆底烧瓶中，加入纯水，在电子加热套上回流提取，合并滤液后用旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏，放入烘箱中干燥后粉碎，得到桑叶水提物。取100 mg 提取物置于1 mL 纯水中，制成待测的水提液用于抑菌试验。

2.2.10 抑菌圈直径的测定

在无菌条件下，取100 μL 菌悬液均匀涂布于固体培养基表面，用无菌镊子夹取抑菌纸片紧贴于固态培养基表面，再取10 μL 桑叶水提物样品于纸片上，设定水为空白对照，重复3次，37 ℃培养18～24 h，观察并准确测量透明圈直径，评价抑菌效果。透明圈直径＞7 mm，判定为有抑菌效果；透明圈直径≤7 mm，判定为无抑菌效果[11]。

2.3 数据统计及分析

利用SPSS 25.0 进行数据处理和分析，使用GraphPad Prism 8.0.2 对实验数据进行绘图。

3 结果与分析

3.1 单因子试验结果

3.1.1 提取次数对浸膏得率的影响

在其他条件不变的前提下，提取1、2、3、4、5 次的平均浸膏得率分别为16.32%、25.41%、26.04%、26.42%、27.15%。由图1 可知随提取次数的增加，桑叶水提浸膏得率也增加，后趋势变化趋于平稳，考虑到经济效益等因素，故选定提取次数（1 次、2 次、3 次）进行正交试验。

图1 提取次数对桑叶浸膏得率的影响

3.1.2 提取时间对浸膏得率的影响

在其他条件不变的前提下，提取时间0.5、1、1.5、2、2.5 h 的平均浸膏得率分别为14.31%、14.39%、16.59%、15.63%、15.02%。由图2 可知随提取时间的增加，桑叶水提浸膏得率在1.5 h 达到峰值，此时浸膏得率的平均值为16.59%，后随着提取时间的增加，浸膏得率呈下降趋势，故选定提取时间（1 h、1.5 h、2 h）进行正交试验。

图2 提取时间对桑叶浸膏得率的影响

3.1.3 溶剂倍数对浸膏得率的影响

在其他条件不变的前提下，溶剂倍数10∶1、12∶1、14 ∶1、16 ∶1、18 ∶1 mL/g 的平均浸膏得率为14.43%、15.56%、18.35%、19.59%、19.72%。由图3可知随溶剂倍数的增加，桑叶水提浸膏得率也增加，后趋势变化趋于平稳，考虑到经济效益等因素，故选定溶剂倍数（14∶1、16∶1、18∶1 mL/g）进行正交试验。

图3 溶剂倍数对桑叶浸膏得率的影响

3.2 正交试验结果

正交试验设计以单因子试验所得提取条件为基础，选择提取次数、提取时间、溶剂倍数为影响因子，以浸膏得率及浸膏中总黄酮含量的综合评分为考察指标进行3 因素3 水平正交试验。正交试验结果与分析如表2 所示。由表2 中极差（R）的大小可知，各因素对浸膏得率及浸膏中总黄酮含量的影响程度为：提取次数>溶剂倍数>提取时间。方差分析结果如表3 所示，各因素对浸膏得率及浸膏中总黄酮含量的综合评分无显著影响，为节约工艺成本与能源，选取最佳水提工艺为A3B1C3，即提取次数3次、提取时间1 h、溶剂倍数18∶1 mL/g。

表2 正交试验结果与分析

表3 方差分析结果

3.3 最佳工艺条件下的浸膏得率及总黄酮含量

在最佳水提工艺参数下，重复试验3 次进行验证，得到桑叶水提物浸膏平均得率为31.13%，总黄酮平均含量约为32.12 mg/g，如表4。

表4 最佳工艺条件下的浸膏得率及总黄酮含量

3.4 抑菌试验结果

由表5 可知桑叶水提物对6 种指示菌中的3种表现出抑制作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、农杆菌的抑制作用明显，抑菌圈直径分别为16.14±1.96、8.31±0.21、9.76±0.72（mm），其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最为突出。桑叶水提物在沙门氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌中未出现抑菌圈。

表5 桑叶水提物对6 种菌的抑菌圈直径

4 讨论

有学者使用AB-8 型大孔树脂对粗提物进行纯化，桑叶粗提物总黄酮含量为12.3 mg/mL，纯化后总黄酮的含量提高至33.8 mg/mL[9]。齐慧娴[12]等采用煮沸法所得珠蓼散提取液测的总黄酮含量为4.12 mg/mL，浸膏得率为15.12%，均优于加热法和渗漉法。与上述研究相比较，本研究所用方法对桑叶水提浸膏得率及总黄酮含量也有较为明显的提高，能够达到减少工艺步骤、节约提取成本的效果。

本试验中影响桑叶水提物浸膏得率及浸膏中总黄酮含量的3 个因素，其对工艺的影响程度为：提取次数>溶剂倍数>提取时间；最佳工艺参数组合：提取次数3 次、提取时间1 h、溶剂倍数18∶1（mL/g）。正交试验和方差分析结果显示，提取次数、提取时间、溶剂倍数对桑叶水提物浸膏得率及浸膏中总黄酮含量的综合评分无显著影响。因此，在不同生产条件和环境下开展桑叶提取物生产之前，应进行详细的试验和论证，以获得该环境下的最优工艺参数水平，确保获得最高的产量。

本研究结果显示，桑叶水提物具有一定的抑菌活性，对6 种指示菌中的3 种均表现出抑制作用，特别是对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌直径达（16.14±1.96）mm。有学者采用牛津杯法进行抑菌试验得出，纯化后的桑叶多糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，桑叶多糖纯度越高对细菌的抑制程度越强[13]。还有学者采用纸片法和牛津杯法测定珠蓼散对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果，得出其对大肠杆菌和沙门氏菌均有较好的体外抑制效果[14]。上述研究结果与本研究结果相似，表明桑叶提取物具有一定抑菌效果，在动物保健和抑菌等方面可能均有较好的效果。因此，利用桑叶提取物作为一种天然的抑菌剂具有良好的开发前景。

5 结论

本试验以桑叶为研究对象，通过单因子试验与正交试验结合，考察提取次数、提取时间、溶剂倍数对桑叶水提物浸膏得率及浸膏中总黄酮含量的影响，筛选出最佳的桑叶水提工艺组合。各因素对桑叶水提物浸膏得率及浸膏中总黄酮含量的影响秩序为提取次数>溶剂倍数>提取时间；桑叶的最佳水提工艺为：提取次数3 次、提取时间1 h、溶剂倍数18∶1（mL/g）。在此工艺参数下，桑叶水提物浸膏平均得率为31.13%，总黄酮平均含量约为32.12 mg/g。体外抑菌试验表明，桑叶水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和农杆菌具有一定的抑制能力，特别是对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，而对沙门氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌无抑菌作用。