不同酿酒酵母对槜李果酒发酵及挥发性香气成分的影响

郭晨晨，王鑫涛，劳凤仙，许光治*

（浙江农林大学 食品与健康学院，浙江 杭州 311300）

槜李又名“醉李”，为蔷薇科（Rosaceae）李属（PrunusLinn.）[1-2]，果形扁圆，果大核小，熟后化浆，蜜甜酒香，原产于浙江嘉兴，其栽培历史有2 500余年[3]。研究表明，槜李果实营养丰富，可溶性固形物含量为17.3%，糖酸比为14.52，维生素C含量为0.238 7 mg/g[1]，还含有类黄酮、多酚、类胡萝卜素等生物活性成分，具有独特的芳香气味，被誉为“群李之冠”[3]。

槜李属于呼吸跃变型水果，果实于6月下旬至7月成熟，采后生理活动旺盛，果实迅速进入呼吸高峰期，易受乙烯作用而快速软化，不耐贮存和运输[4]。目前，对槜李的研究主要集中在贮藏保鲜[4-5]等方面，为了提高其商用价值，可将其加工成果酒销售，营养丰富、口感柔和，能够促进消化，有助于身体健康[6]。在果酒酿造的过程中，酿酒酵母是果酒发酵的主导微生物，发酵过程中酵母的生长代谢会对果酒中的物质组分产生影响，直接影响到所酿果酒的风味及理化性质，决定了果酒品质的优劣[7]。赵文英等[7]选取5种商业酿酒酵母发酵树莓果酒，分析比较酵母发酵曲线、有机酸及非花色苷单体酚类物质含量等，筛选出适合树莓果酒酿造的优良菌株Montrachet。廖丽等[8]以香气成分作为果酒品质的主要评价指标，采用8种酿酒酵母发酵脆红李果酒，得到更适合脆红李发酵的酿酒酵母D254，此酵母发酵的果酒风味较好，具有脆红李的典型风味。当前，果酒的酿造几乎都采用商业酿酒酵母发酵制得[9]，而槜李果酒酿造缺少专用发酵酵母。

本研究以槜李果实为原料，分别以酵母LBY、SLB和SY为发酵菌种，制备槜李果酒，对其理化指标进行检测，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，HSSPME-GC-MS）对挥发性香气成分进行分析，并对其进行主成分分析（principal component analysis，PCA），比较不同酵母对槜李果酒品质的影响，以期筛选出能体现槜李特征的酿酒酵母，为槜李果酒的开发提供理论依据，保证槜李资源的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槜李（成熟度80%）：采自浙江省嘉兴市桐乡市桃园村槜李种植基地；安琪葡萄酒果酒专用酵母SY（简称SY）：湖北安琪酵母股份有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LEVULINE BRG YSEO（简称LBY）和SELECTYS LA BAYANUS（简称SLB）：烟台帝伯仕自酿机有限公司。

芦丁、没食子酸（纯度均＞98%）、甲醇（色谱纯）、1-辛醇（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、福林酚（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZM-60KCS-Ⅱ立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；GL-3250A磁力搅拌器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DGG-9053AD型电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；TGL-20B-C高温台式离心机：上海安亭科学仪器厂；DNP-9082恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；WYT-4型手持糖度计：泉州中友光学仪器有限公司；UV-5500紫外可见分光光度计：METASH上海元析仪器有限公司；QP210PLUS气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 槜李果酒加工工艺流程及操作要点

槜李→挑选、清洗浸泡→打浆、成分调整→接种酵母→恒温发酵→澄清、过滤→灭菌→灌装→成品

操作要点：

原料处理：挑选大小成熟度一致、无病虫害、无机械损伤的槜李，用清水洗刷干净，捞出沥干。

打浆：加入槜李2倍质量的水打浆，添加白砂糖调整可溶性固形物含量为35%[10]，获得槜李果汁。

接种酵母、恒温发酵：将槜李果汁分装于发酵罐中（1 L），记录质量，酵母发酵剂37 ℃温水活化30 min后，以接种量1（106CFU/mL接种，于25 ℃恒温箱中发酵，记录发酵罐的质量，发酵至恒质量即为发酵终点。

澄清、过滤、灭菌：静置后用纱布过滤得清液，在70 ℃下巴氏灭菌20 min，灌装后获得槜李果酒成品。

1.3.2 理化指标的测定

可溶性固形物：采用手持糖度计测定；酒精度：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，采用酒精度计测定；总酸：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，采用酸碱滴定法测定；总酚：参考CHAOVANALIDIT A等[11]的福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂比色法测定；总黄酮：参考硝酸-亚硝酸钠比色法测定[12]；DPPH自由基清除率：参考BARBA F J等[13]的方法测定。

1.3.3 挥发性香气成分的测定

采用HS-SPME-GC-MS检测槜李果汁及槜李果酒中的挥发性香气成分。

HS-SPME条件：取3 mL样品至10 mL顶空瓶内，加入1.0 g氯化钠和50 μL 1-辛醇（质量浓度为500 mg/L），密封后将经老化的萃取针插入样品顶空处，置于50 ℃水浴中，待放稳后推出萃取针头，顶空萃取30 min，将萃取头插入气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪进样口，解吸3 min。

GC条件：RTX-5MS色谱柱（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）；载气为高纯氦气（He）；流速3 mL/min；不分流进样；进样口温度250 ℃；升温程序为起始温度40 ℃，保持5 min，以6 ℃/min升温至120 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升温至250 ℃，保持15 min。

MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；质量扫描范围40～550 m/z。

定性、定量分析：由GC-MS分析得到的质谱数据经计算机在美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）标准谱库的检索比对进行定性（要求匹配度＞800，最大值为1 000）；采用内标法进行半定量分析。

1.3.4 数据处理

所有实验均重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。采用Microsoft Office Excel 2021软件进行数据整理，SPSS Statistics 26.0软件进行统计分析，DataGraph 4.6软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同酿酒酵母的发酵曲线

酵母在发酵过程中分解葡萄糖产生酒精并释放CO2，因此发酵液质量下降速度可作为发酵过程的监测指标，比较酵母SY、LBY和SLB发酵槜李的效果，不同酿酒酵母的发酵曲线见图1。由图1可知，槜李果酒在发酵第8天左右完成主发酵，发酵时间为0～2 d，酵母LBY和SLB的单日质量损失逐渐增加，发酵效力高；第2天，发酵速度达到最大，单日质量损失分别为47.4 g和49.9 g；发酵时间为2～4 d，酵母LBY和SLB的单日质量损失逐渐下降；发酵时间＞4 d，酵母LBY和SLB的单日质量损失趋于平稳。发酵时间为0～4 d，酵母SY的单日质量损失逐渐增加；在发酵第4天，单日质量损失达到最大值，为23.5 g；4～8 d，酵母SY的单日质量损失逐渐下降；发酵时间＞8 d，酵母SY的单日质量损失趋于平稳。总体而言，酵母LBY和SLB的发酵速度快且发酵周期短，适合果酒工业化生产，发酵效果优于酵母SY。

图1 不同酿酒酵母的发酵曲线Fig.1 Fermentation curves of different Saccharomyces cerevisiae strains

2.2 不同酿酒酵母对槜李果酒可溶性固形物和酒精度的影响

可溶性固形物能反映酵母的生长繁殖情况及耗糖能力[10]。由图2可知，3种酿酒酵母发酵过程中槜李果酒的可溶性固形物含量均呈逐渐下降趋势。发酵时间为0～4 d，可溶性固形物含量大幅度下降，发酵时间为4～8 d，可溶性固形物含量趋于稳定。发酵结束时，3种酒样的可溶性固形物含量基本相等，说明这3种酵母的发酵程度接近，与酵母发酵曲线相吻合。其原因可能是发酵初期酵母利用槜李浆液中可发酵性糖，为其生长繁殖提供能量和营养，导致可溶性糖类大量减少，随着发酵进程，发酵液中酒精度和酸度增加，酵母开始沉降和衰亡[14]，分解糖的能力降低。

图2 不同酿酒酵母发酵过程中可溶性固形物含量的变化Fig.2 Changes of soluble solid contents during the fermentation with different Saccharomyces cerevisiae strains

发酵结束时，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的酒精度分别为9.6%vol、9.4%vol和8.6%vol，均符合国标GB/T 15037—2006《葡萄酒》要求。

2.3 不同酿酒酵母发酵对槜李果酒总酸的影响

不同酿酒酵母发酵过程中总酸含量的变化见图3。由图3可知，发酵时间为0～2 d时，除了酵母SY发酵酒样，槜李果酒样品总酸含量逐渐下降；当发酵时间2～4 d时，3个酒样总酸含量逐渐增加；当发酵时间＞4 d时，总酸含量的变化趋于平稳。其原因可能是，发酵初期部分酸类物质被代谢，生成酯类物质，之后随着发酵进程产生其他挥发酸，总酸又增加至适当水平[15]。发酵结束时，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的总酸含量分别为9.04 g/L、8.19 g/L和7.52 g/L，可见不同酵母发酵酒样的总酸含量存在显著差异（P＜0.05），其中，酵母SLB发酵酒样的总酸含量较低，说明其在发酵槜李果酒中起到一定降酸效果。据研究报道[1，6]，李子果酒因酸度较高而影响口感，槜李果实中含有苹果酸、奎尼酸、柠檬酸等有机酸，其中苹果酸高达12.1 mg/g，因此，酵母在果酒发酵过程中的降酸能力也值得关注。总体而言，酵母SY、LBY发酵酒样的总酸较发酵前有所上升，而酵母SLB发酵酒样的总酸含量较初始值降低7.4%，表现出良好的降酸能力，在保持酒体口感平衡方面具有优势。

图3 不同酿酒酵母发酵过程中总酸含量的变化Fig.3 Changes of total acid contents during the fermentation with different Saccharomyces cerevisiae strains

2.4 发酵过程中总酚和总黄酮含量变化及抗氧化性分析

2.4.1 不同酿酒酵母发酵对槜李果酒总酚和总黄酮的影响酚类、黄酮类物质对果酒的感官特性和营养性质等有重要影响，是果酒中起抗氧化作用的主要功能性成分[16]。不同酿酒酵母发酵过程中总酚和总黄酮含量的变化见图4。由图4可知，发酵时间为0～4 d时，3种酵母发酵酒样的总酚含量均呈逐渐下降趋势；发酵时间＞4 d时，总酚含量变化趋于平稳。发酵结束时，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的总酚含量分别为0.59 g/L、0.55 g/L和0.53 g/L，无显著差异（P＞0.05），槜李果酒的总酚保留率约25%。主要原因是酚类物质为热敏性物质，一方面，多酚等大分子物质在酶的作用下分解；另一方面，酚类物质与发酵过程中的次级代谢产物发生氧化、聚合等化学反应，随着发酵进程，损失越严重[17]。哈之才等[18]研究发现，寒富苹果酒发酵过程中的总酚含量呈波动减少趋势，保留率约40%；胡冀太等[19]研究发现，山楂酒发酵过程中总酚含量呈上升趋势，而李楠等[20]研究发现，山楂酒发酵过程中总酚含量几乎保持平稳。由此可知，果酒发酵过程中对总酚含量变化的研究结果并不一致，这可能与水果自身特性、发酵工艺条件（如预处理方式、发酵温度）等有关[21]。

图4 不同酿酒酵母发酵过程中总酚（A）和总黄酮（B）含量的变化Fig.4 Changes of total phenols (A) and total flavonoids (B)contents during the fermentation with different Saccharomyces cerevisiae strains

发酵0～4 d时，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的总黄酮含量呈下降趋势；发酵时间为4 d时，总黄酮含量均下降到最低值，可能是黄酮类物质发生氧化反应导致含量减少；当发酵时间为4～6 d时，总黄酮含量逐渐增加，可能原因是黄酮类物质随着酒精度的增加被浸提出来；当发酵时间＞6 d时，总黄酮含量有所下降，这是由于酒样与空气接触发生氧化反应。发酵结束时，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的总黄酮含量分别为1.16g/L、1.31g/L和0.93g/L，相较于初始值仍有一定程度降低，且下降幅度存在显著差异（P＜0.05），其中，酵母LBY发酵酒样的总黄酮含量相对较高。

2.4.2 不同酿酒酵母发酵对槜李果酒抗氧化活性的影响

由图5可知，在发酵过程中，酵母SY、LBY发酵酒样的DPPH自由基清除率呈先下降后上升再下降的趋势；酵母SLB发酵酒样的DPPH自由基清除率呈先下降后趋于平稳的趋势，发酵结束时，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的DPPH自由基清除率分别为76.16%、73.65%和70.56%，无显著差异（P＞0.05）。

图5 不同酿酒酵母发酵过程中抗氧化活性的变化Fig.5 Changes of antioxidant activities during the fermentation with different Saccharomyces cerevisiae strains

2.5 不同酿酒酵母发酵槜李果酒的挥发性香气成分分析

2.5.1 挥发性香气成分的气相色谱-质谱分析

槜李果汁及不同酿酒酵母发酵槜李果酒的挥发性香气成分检测结果见表1。由表1可知，槜李果汁共检测出31种挥发性香气成分，相对含量为89.96%。3种槜李果酒中共检测出59种挥发性香气成分，包括酯类34种，醇类10种，酸类5种，醛酮类5种，酚类2种和其他类3种，相对含量分别为81.45%、13.58%、2.84%、0.86%、0.65%、0.63%；酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的挥发性香气成分分别检测出47种、37种、41种，挥发性香气成分相对含量分别为86.45%、92.48%、92.19%，其中酯类物质种类最多，含量最高。检出共有挥发性香气成分29种，占比49%，说明3种酵母间有一定发酵共性。经过发酵，槜李果酒挥发性香气成分中酯类物质的种类和相对含量增加，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的酯类物质种类分别增加14种、5种、9种，相对含量分别增加59.05%、65.51%、48.44%；醇类物质的种类数量基本不变，相对含量明显减少，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的醇类物质相对含量分别减少45.39%、46.01%、29.75%；醛酮类物质的种类和相对含量明显减少，酵母SY、LBY、SLB发酵酒样的醛酮类物质种类分别减少5种、4种、3种，相对含量分别减少21.42%、20.29%、20.68%。相较于发酵前，挥发性香气成分种类和相对含量增加，说明酵母发酵起到改善果酒风味的效果。

表1 槜李果汁及不同酿酒酵母发酵槜李果酒的挥发性香气成分检测结果Table 1 Determination results of volatile aroma components in plum juice and plum wines fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

酯类物质是果酒中主要呈香和呈味化合物，主要产生于酵母发酵过程，有助于酒体形成浓郁厚重的风味[22]。酯类物质是3种酵母所发酵槜李果酒香气的主体成分，其中酵母LBY发酵酒样的酯类物质相对含量最高，达到81.45%。酵母SY、LBY、SLB发酵酒样中分别检测出酯类物质28种、19种和23种，其中共有成分16种。辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯在3种酒样中均检出，且相对含量较高，赋予槜李果酒白兰地酒香、脂肪香、菠萝、香蕉和梨香[23]，辛酸乙酯和癸酸乙酯是相对含量最高的2种酯类物质，这与刘晓柱等[24]制备的空心李果酒的研究结果一致。此外，酵母SY发酵酒样中检出顺式-4-辛烯酸乙酯和乙酸苯乙酯，赋予酒体苹果香、玫瑰花香和蜂蜜味；酵母SLB发酵酒样中检出乙酸丁酯、异丁酸异戊酯、丁酸戊酯、顺式-3-己烯酸乙酯和月桂酸乙酯，赋予酒体苹果、杏子、桃等水果香[23]、青草香和奶香。

醇类物质是构成果酒风味特征的重要香气成分，主要来源于酵母发酵过程中氨基酸代谢或糖代谢[25]，其种类和含量受菌种、发酵过程等多种因素影响[26]。3种酒样中共检测出醇类物质10种，其中共有成分7种，分别为异戊醇、异丁醇、正己醇、叶醇、（S）-2-辛醇、正辛醇、苯乙醇，赋予槜李果酒白兰地香气、青草香、茉莉、柠檬和玫瑰花香[27]。在3种酒样中，酵母SLB发酵酒样的醇类物质相对含量最高，为22.90%，其检出的7种共有醇类物质相对含量也最高，这些高级醇对果酒香气形成有积极作用，能增加酒体复杂感，并有衬托酯香的作用[29]。芳樟醇仅在酵母SY发酵酒样中检出，是该种酒样的特有香气成分，可赋予酒体玫瑰花香、柑橘香[30]。除辛醇外，其他5种醇类物质也在赵驰等[28]制备的李子果酒中检出，为发酵过程中主要变化的醇类物质。

酸类物质是果酒香气的重要协调成分，适量的酸能改善果酒的口感和色泽[29]，含量过多会产生酸败和刺激性异味。酵母SY、LBY、SLB发酵酒样中酸类物质相对含量分别为2.93%、2.55%和2.22%，3种酒样中共检测出酸类物质6种，其中共有成分3种，分别为辛酸、癸酸和己酸。辛酸是槜李果酒中检出相对含量最高的挥发酸，这与高红芳等[26]制备的黑布林果酒的研究结果一致，稀释后呈水果香气，能赋予酒体草莓、菠萝、桃等水果风味[26-27]；癸酸和己酸可赋予酒体脂肪味、奶酪味。异丁酸仅在酵母SLB发酵酒样中检出，也能赋予酒体奶酪味。

由表1可知，槜李果酒中还检测到醛酮类、酚类和其他类香气成分。醛酮类、酚类物质虽然相对含量低，但对酒体特征风味的形成仍有一定贡献。3种酒样中均检出的仲辛酮带有花草香，酵母SY、SLB发酵酒样中检出的癸醛带有柑橘香、蜡香[23]，酵母LBY、SLB发酵酒样中检出的苯甲醛带有杏仁味、风信子香[23]，酵母SY发酵酒样中检出的异丁香酚带有丁香味[30]，它们能对槜李果酒的香气起补充和修饰作用。

2.5.2 主成分分析

由于发酵香气成分复杂，为直观体现3种酿酒酵母发酵槜李果酒的香气成分差异，对槜李果汁及发酵酒样的挥发性香气成分进行主成分分析，结果见表2。由表2可知，以特征值>1.0的原则提取出2个主成分，PC1和PC2方差贡献率分别为52.627%和33.115%，前2个主成分累计方差贡献率为85.742%，基本能反映香气成分的大部分信息，可作为数据分析的有效成分。挥发性香气成分主成分分析得分图和因子载荷图见图6。

表2 主成分的特征值及方差贡献率Table 2 Eigenvalues and variance contribution rates of principle components

图6 槜李果酒样品挥发性香气成分主成分分析得分图（A）和载荷图（B）Fig.6 Score plot (A) and load plot (B) of principal component analysis of volatile aroma compounds in plum wines samples

由图6可知，4种样品具有明显的区域分布特征，酵母SLB发酵酒样位于PC1和PC2正半轴，酵母LBY和SY发酵酒样均位于PC1正半轴和PC2负半轴，槜李果汁位于PC1和PC2负半轴，3种槜李果酒与槜李果汁相距较远，且PC1正半轴香气物质和呈香类型较多，说明3种酿酒酵母均有较好的产香性能。具体来说，酵母SLB发酵酒样位于第一象限，己酸乙酯、乙酸异戊酯、壬酸乙酯、己酸、异丁醇等为其特征香气成分，呈菠萝、香蕉等水果味、玫瑰花香、奶酪味和生青味。酵母SY和LBY发酵酒样同时位于第四象限且距离较近，癸酸乙酯、辛酸、癸酸为2种酒样的主要香气成分，呈花果香、水果味和奶酪味；辛酸甲酯、己酸异戊酯、9-癸烯酸乙酯等为酵母SY发酵酒样的特征香气成分，呈甜橙香、苹果和菠萝等水果味、生青味；辛酸异戊酯、癸酸异戊酯等为酵母LBY发酵酒样的特征香气成分，呈白兰地酒香、玫瑰花香。槜李果汁位于第三象限，乙酸丁酯、乙酸叶醇酯、己醛等为其特征香气成分，呈菠萝味、水果香和青草香。

3 结论

该研究以槜李果实为原料，选用3种酿酒酵母发酵菌种制备槜李果酒。结果表明，3种酵母的发酵程度基本相同，酵母LBY和SLB发酵速度快且发酵周期短，发酵效果优于酵母SY。从理化指标来看，不同酵母发酵酒样的酒精度均符合国标要求，酵母SLB具有降酸作用，其发酵槜李果酒的酒精度为8.6%vol，总酸含量为7.52 g/L。不同酒样均具有一定的抗氧化活性；不同果酒样品的总酚含量、DPPH自由基清除率无显著差异（P＞0.05），酵母LBY发酵酒样的总黄酮含量较高。从挥发性香气成分来看，槜李果酒共检出挥发性香气成分59种，其中，酯类34种、醇类10种、酸类5种、醛酮类5种、酚类2种和其他类3种，共有成分29种，3种酒样的特征香气成分呈香效果相似，以花果香和奶香为主，其中酵母SLB发酵酒样的挥发性香气成分种类较多、相对含量较高，检出乙酸丁酯、月桂酸乙酯等多种特有香气成分，酒体香气更复杂。综合比较，酵母SLB更适合于槜李果酒的发酵。