酿酒酵母对无醇啤酒酿造特性及风味的影响

佟恩杰，李小燕，赵 凯，李 慧，陈文波，杨海莺，卢 玉，杜以俊*

（1.中粮麦芽（大连）有限公司，辽宁 大连 116200；2.中粮营养健康研究院有限公司 老年营养食品研究北京市工程实验室，营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京 102209；3.南京财经大学 食品科学与工程学院 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023；4.中粮粮谷控股有限公司，北京 100020）

无醇、低醇啤酒指不含酒精或酒精含量甚微的啤酒，在我国一般认为酒精度低于0.5%vol为无醇啤酒[1-2]。无醇啤酒最早由瑞士推出，随后德国、美国、英国、日本等国家相继开发出同类产品并占据了一定的市场份额[3]。在我国，年轻人、运动员、司机、酒精不耐受人群等消费者对无醇啤酒的需求也不断增加[4]。

无醇啤酒生产方法很多，核心可以分为在发酵阶段控制酒精的产生和发酵后对酒精成分的去除或减少[5]。发酵后去除酒精是目前市场上大多数无醇啤酒产品的生产方法，通常采用低温蒸馏方法或反渗透法等，但存在工艺复杂、能耗高及啤酒风味发生改变等问题[6]。控制酒精产生的方法包括使用特殊的发酵酵母菌株、高温糖化麦汁、低温发酵等。在发酵阶段控制酒精的产生优点是无需额外的设备投资，缺点在于糖化或发酵工艺发生变化且工艺控制要求高[7]。因此，选育无醇啤酒酵母开发无醇啤酒是目前的研究热点[8]。宋刚等[9]以自行构建的工程菌株为发酵菌株，进行无醇啤酒发酵的初步探索，并进行1 t发酵罐密闭发酵工艺试验，可使发酵液乙醇含量低于1%；刘杨等[10]使用路德类酵母生产无醇啤酒，当原麦汁浓度低于8°P 时，酒精度可达到低于0.5%vol的无醇啤酒要求；康虹等[11]利用假丝酵母开发无醇啤酒，能产生具有杏仁风味的水杨醛。上述研究表明选育无醇啤酒酵母开发无醇啤酒的可行性，但无论工程菌、路德类酵母还是假丝酵母，与啤酒工业普遍使用的酿酒酵母都有所区别，商业化生产应用未见报道。

本研究利用实验室保藏无醇酿酒酵母和商业对照无醇酿酒酵母，以特种麦芽为酿造原料，采用普通啤酒发酵工艺，研究酿酒酵母对无醇啤酒酿造特性及风味的影响。通过测定不同酵母的啤酒发酵性能、麦汁糖发酵利用率、酒精转化能力及所酿啤酒的理化指标，并采用顶空固相微萃取（headspace-solid phase micro-extraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用法分析不同酵母酿造啤酒风味物质的差异性，最终选出适合无醇啤酒酿造的酿酒酵母菌种，以期为简化无醇啤酒生产工艺，酿造高品质的无醇啤酒提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

特种麦芽：使用进口大麦，采用特殊制麦工艺、特殊设备制成的具有较低可发酵性糖的特种麦芽，中粮麦芽（大连）有限公司。

商业对照无醇啤酒活性干酵母：法国弗曼迪斯酵母有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y272、Y273、Y274，本实验室-80 ℃甘油管冷冻保藏。

酒花：萨兹（Saaz）和亚麻黄（Amarillo），市售。

1.1.2 化学试剂

酵母粉、蛋白胨、琼脂（均为生化试剂）：北京陆桥技术有限责任公司；葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、氯化钠、浓硫酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1,2,3-三氯丙烷（色谱纯）：北京曼哈格生物科技有限公司；正构烷烃（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.1.3 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）琼脂培养基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L。调节pH 6.0，于121 ℃灭菌20 min，备用。

麦汁培养基：8°P麦汁，自然pH值[10]，115 ℃灭菌20 min，备用。

1.2 仪器与设备

N812C低温恒温培养箱、SQ510C立式压力蒸汽灭菌器：日本YAMATO公司；THZ-100恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；HDZS60-D啤酒酿酒生产线：哈尔滨汉德轻工医药装备有限责任公司；ME203天平：美国梅特勒公司；PB-10酸度计：德国赛多利斯公司；DMA 4500M密度仪：奥地利Anton Paar公司；LA-20AT高效液相色谱仪、Nexis GC-2030气相色谱仪（配HSS-30A顶空进样器、火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）、ECD检测器）、GCMS-2020NX气相色谱质谱联用仪（AOC-6000多功能自动进样器）：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母活化

取甘油冻存管保藏的酿酒酵母菌液1环接种于YPD斜面培养基，25 ℃培养72 h后，活化扩培参考孙可澄等[12]的方法。市售无醇啤酒活性干酵母（1.0×1010CFU/g）活化使用10倍于酵母质量的无菌水，25～29 ℃保持15～30 min后使用。

1.3.2 啤酒酿造工艺流程及操作要点

麦芽→粉碎→糖化→过滤→煮沸→过滤→麦汁浓度调整→接种酵母→发酵→后熟→无醇啤酒原液

操作要点：

麦芽粉碎：调节麦芽粉碎机对辊间距，控制麦芽粉碎度为1.0 mm。

麦汁制备：将麦芽粉与水按料液比1∶5（g∶mL）混合均匀，65 ℃糖化60 min后过滤，煮沸滤液，煮沸过程添加酒花，添加量为0.02%。煮沸后趁热过滤，调整麦汁浓度至8°P备用。

实验室模拟啤酒发酵：使用灭菌的1 L三角瓶分装麦汁，装液量100 mL/250 mL。将活化酵母接种于麦汁，使酵母活菌数约为1×106CFU/mL。使用透气封口膜或添加有浓H2SO4的发酵栓封口。静置培养，培养温度为18 ℃。麦汁接种前、接种后，以及发酵过程中，透气封口膜封口，样品每天取样，发酵栓封口样品每天早晚两次称质量并记录，单日质量损失低于0.1 g/400 mL代表发酵结束。发酵结束后将发酵上清液转入无菌啤酒瓶，0～4 ℃后熟，得到无醇啤酒原液。

30 L啤酒发酵罐发酵：将扩培酵母泥接种到麦汁中，接种后酵母活菌数约为1×106CFU/mL，发酵温度为18 ℃，发酵过程中使用密度仪测定麦汁的密度变化情况，当密度连续2 d不再发生变化时认为发酵结束。发酵结束后，降低发酵罐温度至0～4 ℃，进入后熟阶段。待酵母沉降完毕时，无明显双乙酰气味，完成无醇啤酒的酿造。

1.3.3 酵母生长测定

发酵液梯度稀释后涂布于YPD平板，28 ℃培养72 h后计算活菌数。

1.3.4 酵母可发酵性糖检测

无菌取麦汁、发酵液及啤酒的上层液，以0.45 μm孔径的滤膜进行过滤得到待测液，按李慧等[13]的方法检测。色谱柱：Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），柱温：65 ℃；流动相0.005 mol/L H2SO4，流速0.60 mL/min；检测器为示差检测器，进样量为20 μL。

1.3.5 麦汁发酵液及啤酒理化指标检测

酒精度：根据团体标准T/CBJ 3108—2021《无醇啤酒》进行检测[2]；双乙酰、总酸、原麦汁浓度、发酵度：根据国标GB/T4928—2008《啤酒分析方法》进行检测[14]；糖度、比重：使用DMA 4500M密度仪检测；pH值：采用pH酸度计检测；表观发酵度：参考《啤酒工业》手册[15]。

1.3.6 无醇啤酒挥发性化合物检测

（1）样品前处理

取5 mL啤酒样品至20 mL螺口顶空进样瓶，准确加入1,2,3-三氯丙烷（10 mg/L）内标溶液150 μL，加密封垫、铝盖压紧摇匀。将准备好的顶空测试样品，放置于顶空固相微萃取自动进样系统，60 ℃恒温振荡10 min，待顶空风味物质浓度达到平衡后插入固相微萃取探针，萃取30 min后拔出，插入进样口，脱附3 min[16]。

（2）气相色谱条件

参考VIEIRA A C等[17-18]的方法，色谱柱：DB-WAX 57CB（50 m×0.25 mm，0.2 μm）；载气：99.999%高纯度氦气（He），载气流速1 mL/min；进样口温度：250 ℃；解吸时间1 min；升温程序：初始温度40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min速度上升到150 ℃，随后以4 ℃/min速度上升到230 ℃，保持8 min；进样量1 μL，不分流进样；溶剂延迟时间2 min。

（3）质谱条件

电离模式：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃；扫描方式：质谱扫描范围：30～500 m/z。

（4）定性定量分析方法

通过GC-MS检测分析啤酒挥发性化合物总离子流图，自动识别信噪比（S/N）＞200的色谱峰，运用美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14谱库与样品色谱峰进行比对分析，筛选得到匹配度＞80%的物质，并结合保留指数（retention index，RI）进行定性分析，计算值与文献值差值＜50。以1,2,3-三氯丙烷作为内标物，计算各挥发性化合物质量浓度（mg/L）。

1.3.7 风味化合物气味活度值分析

与文献报道的挥发性化合物香气特征进行比对，筛选风味化合物，根据啤酒中风味化合物的质量浓度及各物质的香气阈值，计算各风味化合物的气味活度值（odor activity value，OAV）[19-20]。

1.3.8 感官评价

发酵结束后，组织专业培训的品评人员组成感官分析品尝小组，参考T/CBJ 3108—2021《无醇啤酒》[2]及GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[14]对啤酒的香气、口感及有无明显缺陷等方面进行感官分析。

1.3.9 数据处理

所有的试验进行3次，使用Microsoft Excel 2013进行数据分析，数据为“平均值±标准差”，使用OriginPro 2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 实验室模拟啤酒发酵过程酵母麦汁发酵速率及生长曲线

不同酿酒酵母在实验室模拟啤酒发酵过程中，CO2质量损失变化及酵母生长曲线见图1。

图1 不同酵母麦汁发酵过程中CO2质量损失变化及酵母生长曲线Fig.1 Changes of CO2 mass loss and growth curve during wort fermentation process with different yeasts

如图1可知，以商业无醇酿酒酵母为对照，3株实验室保藏无醇酿酒酵母表现出了较好的生长及发酵性能。酵母Y272、Y273和商业对照无醇酿酒酵母在麦汁中发酵第1天开始进入稳定期，细胞数分别增殖到1.0×108CFU/mL、1.0×108CFU/mL和1.2×108CFU/mL，此时，CO2每日质量损失分别为0.31 g/400 mL、0.29 g/400 mL和0.52 g/400 mL。酵母Y274发酵到第3天才开始进入稳定期，此时，CO2每日质量损失为0.54 g/400 mL。酵母Y272、Y273生长速度和起始发酵速度快，酵母Y274生长速度和起始发酵速度慢。

2.2 实验室模拟啤酒发酵麦汁糖的利用

用酵母消耗糖的质量浓度与麦汁初始糖的质量浓度的百分比表示酵母麦汁发酵糖的利用率，不同酵母对麦汁中不同糖的利用结果见表1。

表1 实验室模拟啤酒发酵麦汁中不同酵母对糖的利用率Table 1 Utilization rate of sugar in fermented wort of beer simulated by different yeasts in laboratory

由表1可知，原麦汁果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽三糖的质量浓度较低，麦芽糖和异麦芽糖的浓度较高。3株实验室保藏无醇酿酒酵母和和商业对照无醇酿酒酵母对果糖、葡萄糖和蔗糖的利用率很高，均可达到86%以上，但基本不利用麦芽糖、异麦芽糖和麦芽三糖。这与路德类酵母对麦汁中糖的利用率结果相似[10]。

2.3 不同酿酒酵母对实验室模拟发酵啤酒理化指标的影响

发酵结束后，对不同菌株发酵啤酒的理化指标进行检测，结果见表2。

表2 不同酵母实验室模拟发酵啤酒的理化指标Table 2 Physicochemical indexes of different beer samples brewed by different yeasts in laboratory

由表2可知，与商业对照酵母相比，3株实验室保藏无醇酿酒酵母的发酵度较低，为17%左右，产生的酒精度低，分别为0.52%vol（商业对照）、0.43%vol（Y272）、0.48%vol（Y273）及0.49%vol（Y274）。发酵啤酒的pH值较高，为4.75左右，这与发酵产生的酸较少有关。同时，发酵啤酒中的双乙酰含量＜0.05 mg/L，在啤酒双乙酰的风味阈值（0.1 mg/L）之内。3株实验室保藏无醇酿酒酵母酿造啤酒的理化指标均满足无醇啤酒标准要求[3]，可用于无醇啤酒酿造。

2.4 不同酿酒酵母对实验室模拟发酵啤酒风味化合物的影响

采用HS-SPME/GC-MS法检测不同酿酒酵母实验室模拟发酵啤酒中的挥发性化合物，测定啤酒中挥发性化合物的含量并计算OAV，分析结果见表3。

表3 不同啤酒挥发性化合物的组成及含量Table 3 Composition and contents of volatile compounds in different beer samples produced with different yeasts

由表3可知，4种啤酒（实验室保藏无醇酿酒酵母Y272、Y273、Y274及商业对照无醇酵母酿造啤酒）中共检测出92种挥发性化合物，分别为47种、49种、49种及48种。以酯类化合物和醇类化合物含量最高，酵母Y272酿造啤酒还富含醛类化合物。与文献报道的挥发性化合物香气特征进行比对，从HS-SPME/GC-MS挥发性化合物分析结果中筛选OAV≥1的风味化合物[21]，结果表明，4种啤酒共筛选出OAV≥1的酯类化合物12种，醇类化合物4种，醛类化合物5种，酸类化合物2种，酮类化合物2种，其他类化合物2种。

酯类化合物是啤酒的重要风味物质，也是啤酒香气的主要载体，主要在主发酵期间形成[22-23]。由表3可知，4种啤酒中OAV均≥1的酯类化合物有8种，其中，乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸甲酯、癸酸乙酯OAV均较高，赋予酒体花香味（橙花、茉莉花、玫瑰花）、果味（菠萝、柑橘、梨）、酒味等气味特征。与商业对照无醇酿酒酵母相比，癸酸甲酯是3种实验室保藏无醇酿酒酵母酿造的啤酒最具有香气活性的风味物质，赋予酒样浓郁的脂香和果香味，尤其酵母Y274酿造的啤酒（癸酸甲酯OAV为1 090.87）。乙酸苯乙酯也是3种实验室保藏无醇酿酒酵母酿造啤酒的特有的OAV＞1的风味物质，赋予酒样甜味、蜂蜜味、玫瑰花香味。

醇类化合物是啤酒的基本风味物质，对啤酒风味有重大影响，绝大部分来源于酵母发酵过程中的氨基酸代谢或糖代谢，也是某些酯类物质的前体物质[24]。4种啤酒中的OAV均＞1的醇类化合物有3种，分别为（±）-2-甲基-1-丁醇、1-癸醇和苯乙醇，赋予啤酒花香味（玫瑰）、果味（柑橘）、酒味（葡萄酒）、香料味（丁香）、蜂蜜味、脂肪味、青草味、洋葱味。与商业对照酵母相比，酵母Y272、Y274酿造的啤酒中异戊醇的OAV＞1，带给啤酒威士忌味，麦芽味，烧焦味。

醇类和酯类是啤酒风味物质中最主要的组成部分[13]，醇酯比是评价啤酒风味特点的重要依据，一般醇酯比在3～4较理想，但目前多数啤酒偏低[13]。从表3可以看出，酵母Y272、Y274和商业对照无醇酵母酿造啤酒的醇酯比在1～2之间，酵母Y273酿造啤酒的醇酯比为2.64，接近3～4的理想醇酯比例，这有助于啤酒风味和香气的协调性。

醛类物质普遍具有强烈的气味特征[25]，新鲜啤酒中的醛类化合物主要形成于麦汁或酵母酿造过程，4种啤酒OAV＞1的醛类物质各有不同。2-甲基丁醛、异戊醛和十二醛是酵母Y272酿造啤酒的主要醛类风味化合物，呈现可可味，杏仁味，麦芽味，柑橘味，肥皂味，蜡味；苯乙醛是酵母Y273酿造啤酒的主要醛类风味化合物，呈现山楂味，蜂蜜味，甜味；异戊醛、十二醛是酵母Y274酿造啤酒的主要醛类风味化合物，呈现麦芽味；2-甲基丁醛是商业对照无醇酵母酿造啤酒的主要醛类风味化合物，呈现可可味，杏仁味。

除此之外，4种酒样中的酸类、酮类和其他类挥发性化合物也有OAV＞1的风味化合物，这些物质对啤酒的香气起到比较重要的补充和修饰作用。其中，大马士酮在3种啤酒中的OAV＞5 000（酵母Y272、Y273及商业对照无醇酵母酿造啤酒），赋予啤酒馥郁的苹果味，玫瑰味及蜂蜜味。综上所述，酵母Y273酿造啤酒的风味化合物种类丰富，香气特点突出。

2.5 实验室模拟发酵啤酒感官评价

对实验室模拟发酵啤酒的香气、口感及有无明显缺陷予以感官评价，根据品评记录得分绘制风味雷达图，结果见图2。

图2 不同酵母酿造啤酒风味品评结果雷达图Fig.2 Radar chart of flavor evaluation results of different beer samples brewed by different yeasts

由图2可知，从风味来看，4种啤酒无明显缺陷型香气，酒花香气明显。与商业对照无醇酿酒酵母相比，酵母Y272、Y273酿造的啤酒果香突出，分值分别为2.87和2.84。尤其酵母Y273酿造的啤酒花香、果香细腻协调，这与该酵母酿造啤酒具有相对丰富的酯类、醇类和醛类等化合物及较好的醇酯比例（2.64）有一定的关系。从口味来看，4种啤酒无明显异味，有杀口感。从酒体饱满度来看，酵母Y273酿造的啤酒酒体饱满度分值最高，为1.92。综合评价，酵母Y273酿造的啤酒风味协调，纯正爽口，酒体饱满，适合酿造无醇啤酒。

2.6 酿酒酵母发酵罐啤酒发酵稳定性验证

综合发酵速率、啤酒理化指标、风味化合物分析及感官评价结果，选择酿酒酵母菌株Y273采用30 L发酵罐进行啤酒酿造放大试验，结果见表4。

由表4可知，酵母Y273发酵罐酿造啤酒的酒精度满足T/CBJ 3108—2021《无醇啤酒》要求[2]，双乙酰含量符合GB/T 4927—2008《啤酒》要求[1]。说明这株菌可在发酵罐中放大发酵，具有非常好的无醇啤酒酿造应用潜力。

3 结论

本研究选用3株实验室保藏无醇酿酒酵母与商业对照无醇酿酒酵母及特种麦芽，使用普通啤酒发酵工艺，研究酿酒酵母酿造无醇啤酒的发酵性能、酿酒酵母对可发酵性糖的利用率，并对所酿啤酒的理化指标进行检测，同时采用HS-SPME/GC-MS分析比较不同酵母酿造啤酒的风味差异。结果表明，相比较其他两株实验室保藏无醇酿酒酵母及商业对照无醇酿酒酵母，酵母Y273发酵性能好，可发酵性糖利用率为18.55%，所酿啤酒理化指标适中，酒精度0.48%vol，表观发酵度17.21%，pH值为4.76。该酵母所酿造的啤酒风味物质多样，醇酯比例协调，感官评价香气细腻协调。最终确定酵母Y273比较适合酿造无醇啤酒。