赤水河流域不同产区酱香白酒挥发性风味物质差异分析

曾庆军，周鸿翔，2*，曾佳佳，邱树毅，2，刘 凡

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州白酒交易所，贵州 贵阳 550081；4.贵州数字白酒产业发展研究院，贵州 贵阳 550081）

酱香型白酒是各大香型白酒中酿造工艺、微生物体系和风味结构最为复杂的，酱香白酒的不同风格特征与不同类型的基酒勾调密切相关，如不同产地基酒中各类风味化合物含量与种类有较大差异。据初步统计，贵州赤水河流域白酒企业有400家，白酒产能达到40万kL，其中酱香型白酒产能约30万kL，白酒中的风味成分会受到产区因素的影响，即使是同种工艺类型的白酒，产区环境和气候条件都会造成白酒风味的差异[1]。贵州各地具有独特的土壤、水分、地势条件等一系列自然条件，因此不同流域酿造出来的白酒具有不同的口感和风味。对赤水河流域各大酱酒产业不同空间分布及特征影响进行深入研究分析，对于建立赤水河流域不同产区酱香白酒特征模型有重要意义。

近年来，随着气相色谱（gas chromatography，GC）分析技术广泛应用于白酒香气物质的定性定量分析使得白酒质量、香型、品牌的鉴别结果更加准确[2-4]。统计学分析已经逐步渗入到食品科学领域，与仪器检测相结合展示了较高的优越性。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种比较常用的多元统计分析方法，常用于酒类、茶叶和食品等领域[5-8]，正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least-squares-discrimination analysis，OPLS-DA）是在偏最小二乘-判别分析（partial least-squares-discrimination analysis，PLS-DA）的基础上，进行了正交变换的矫正，判别效果及主成分得分图的可视化效果更加明显。李爱兰等[9]使用吹扫捕集-气质联用方法鉴别不同产地、品牌浓香型白酒。基于浓香型白酒的挥发性风味成分的差异，通过OPLS-DA可对其产地进行准确区分，通过变量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）值分析筛选出辛酸乙酯、己酸己酯等40种潜在差异性化合物。程平言等[10]对于白酒原产地的鉴定通过偏最小二乘-判别分析法和逐步线性判别分析法筛选出27个重要特征离子，然后用筛选出的27个特征离子构建反向传播（back propagation，BP）神经网络模型和支持向量机（support vector machine，SVM）模型，其原产地预测准确率分别达96.2%和97.7%。

本研究以赤水河不同产区的酱香型白酒为研究对象，采用气相色谱法对酒样中的64种挥发性风味物质进行定量分析及差异分析，采用正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）构建模型，并利用变量投影重要性（VIP）值筛选差异挥发性风味化合物，并进行聚类分析（cluster analysis，CA）。以期对酱香型地域划分、企业品牌标准体系建立提供研究基础与理论指导，对酱香产区分类有一定指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

51个酱香白酒样品，其中包括16个MT产区系列酒样（MT1～MT16），9个ZJ产区系列酒样（ZJ1～ZJ9），11个XJ产区系列酒样（XJ1～XJ11），10个JS产区系列（JS1～JS10）酒样，5个LJ产区系列酒样（LJ1～LJ5），均由市场采购获得。

叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸（纯度均＞98%）、乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯等35个标准品（纯度≥97.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醛（纯度≥97.0%）：美国Sigma-Aldrich公司；2-甲基丁酸乙酯（纯度≥97.0%）：上海贤鼎生物科技有限公司；异戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯等标准品（纯度均≥97.0%）：上海易恩化学技术有限公司；庚酸乙酯、壬酸乙酯、异丁醇、2,3-丁二醇、异戊醛（纯度均≥97.0%）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪：安捷伦科技有限公司；PAL多功能自动进样器：瑞士斯特分析仪器有限公司；Millipore-Q超纯水系统、2 mL进样瓶：佰奥萃（天津）生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒样预处理

移取5 mL酒样过0.22 μL有机滤膜，吸取990 μL过膜后的酒样于2 mL气相进样瓶中，加入体积分数1%的叔戊醇（内标）溶液10 μL，加盖密封，备用，每个样品重复2～3次。

1.3.2 挥发性风味物质检测

采用气相色谱法检测白酒样品中的挥发性风味物质。

GC条件：SH-Rtx-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为氮气（N2）（99.999%）；进样口温度250 ℃；分流比30∶1；检测器温度250 ℃；氢气流量30 mL/min，空气流量300mL/min，升温程序为初始温度30℃，保持3min，以3℃/min升温至180 ℃，再以15 ℃/min升温至210 ℃，保持8 min。

定性、定量分析：采用保留时间定性，根据张晓婕等[11]方法对白酒风味进行定量，以待测物与内标物的含量比（X）为横坐标，峰面积比（Y）为纵坐标，采用内标法定量酒样中各风味物质。绘制各挥发性风味物质的标准曲线，获得其标准曲线回归方程。

香气活度值（odor active value，OAV）分析：通过查阅相关文献确定每个物质阈值计算得到OAV，一般认为OAV＞1则代表该物质具有贡献作用，计算公式如下：

式中：C为各挥发性物质质量浓度，mg/L；OT为各挥发性物质阈值，μg/L。

1.3.3 正交偏最小二乘-判别分析

从146个观测值中筛选掉异常值后，从每个产区随机选取3个样本作为测试集，共计15个，其余样本为训练集，利用正交偏最小二乘-判别分析构建不同产区酱香白酒鉴别模型。并利用VIP值筛选不同流域酱香白酒产区的挥发性差异物，根据所选差异物绘制层次聚类热图，直观表达风味化合物的潜在联系。

1.3.4 数据处理

采用SIMCA软件13.0进行主成分分析以及模型构建。采用MetaboAnalyst2.0绘制聚类分析热图。

2 结果与分析

2.1 赤水河流域不同产区酱香白酒挥发性风味物质分析

不同产区各挥发性风味化合物相对含量见表1，不同产区酱香型白酒挥发性风味物质测定结果及OAV见表2。由表1和表2可知，不同酒样中共检出挥发性风味化合物64种，其中，酯类19种，醇类13种，酸类8种，醛酮类7种，吡嗪类2种，呋喃类5种，芳香族类8种，酚类2种，不同产区酒样的挥发性风味物质总含量存在差异，ZJ产区酒样挥发性风味物质总含量略偏低，为9 125.45 mg/L，其余酒样总含量较为接近，为11 010.40～11 716.49 mg/L，这与李利利[14]的研究结果一致。不同产区酱香白酒风味物质主要为酯类物质，其次是醇类、酸类、醛酮类，吡嗪类物质在白酒中含量极低，但赋予白酒坚果和焙烤香气，对其他化合物有明显的烘香作用[11]。酯类物质在白酒中能赋予其花香和果香[15]，对白酒空杯后味具有贡献，酸类化合物是重要的呈味物质，能够调和酒体口味、稳定香气[15]，醇类物质沸点低易挥发，对白酒风味层次具有贡献作用[16]。XJ和MT产区酒样中的酯类物质和酸类物质含量较高，且酯类物质中的乙酸乙酯和酸类物质中的乙酸在酱香型白酒样品中的含量最高。JS产区酒样的酯类物质含量最低，但醇类、呋喃类化合物含量最高，LJ产区酒样的酚类化合物和醛酮类化合物明显高于其他产区，MT产区酒样与LJ产区酒样相反，ZJ产区酒样中的芳香族类物质相对含量最高。

表1 不同产区酒样各类挥发性风味化合物相对含量Table 1 Relative contents of various types of volatile flavor compounds in Baijiu samples from different producing areas

表2 不同产区酱香型白酒挥发性风味物质测定结果及香气活度值Table 2 Determination results of volatile flavor compounds and odor active value of sauce-flavor Baijiu from different producing areas

XJ和MT产区酒样酯类和酸类化合物含量明显高于其他产区的原因主要是乙酸乙酯和乙酸含量高，乙酸乙酯和乙酸是酱香白酒中占比最大的酯类和酸类物质。此外，OAV结果表明，乙酸苯乙酯只对XJ产区酒样有香气贡献，乙酸苯乙酯在酿造过程中合成率较低，XJ产区酒样可能具有更多适宜具有合成乙酸苯乙酯能力的微生物。通过计算OAV可知，正戊醇和2-庚醇对JS和LJ产区酒样有香气贡献，对XJ和MT产区酒样则无香气贡献，这可能是造成它们香气差异的主要物质。辛醇对JS产区酒样无香气贡献，而对其余酒样均有贡献，苯甲醛只对JS产区酒样有香气贡献。

为进一步分析赤水河五个不同产区的酱香白酒的香气特征化合物，以对五种酒样的香气具有贡献的化合物（OAV＞1）做载荷分析，结果见图1。由表1和图1可知，碳原子数＞4的酯类物质对LJ产区酒样影响较大，包括辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯，其中己酸乙酯呈水果香和花香，LJ产区酒样果香味较浓，己酸乙酯含量明显高于其他几个酒样，分析原因可能是LJ产区酒样既生产酱香型白酒又生产浓香型白酒，己酸乙酯是浓香型白酒中酯类物质含量最高的物质，在LJ产区酿造环境和酿造工艺中存在一些己酸乙酯的代谢物。乙酸、乙酸乙酯与丙酸、丙酸乙酯之间会发生水解和酯化反应，该四种化合物与MT产区酒样相关性较大，异戊醛、异戊醇、丁酸乙酯、糠醛对JS产区酒样贡献较大，与ZJ和XJ产区酒样相关性较大的多为一些酯类化合物，如异丁酸乙酯、癸酸乙酯、壬酸乙酯、异戊酸乙酯、癸酸乙酯、乳酸乙酯。

图1 基于OAV＞1的特征化合物不同产区酒样的主成分分析载荷图Fig.1 Load diagram of principal component analysis of Baijiu samples from different regions based on characteristic compounds with OAV＞1

2.2 不同产区酱香型白酒挥发性风味物质差异分析

2.2.1 主成分分析

对赤水河流域五个不同产区的酱香型白酒中的64个挥发性风味物质含量的数据进行处理，PCA散点图见图2。由图2可知，五个产区白酒样品大致被分成三类，LJ产区酒样位于坐标轴左下方，JS产区酒样集中位于坐标轴左上轴。MT产区酒样位于坐标轴右上半轴，XJ和ZJ产区酒样基本位于坐标轴下半轴。ZJ、XJ、MT三大产区酒样则集中分布在原点附近，聚集度较高。JS产区酒样组内分布较为散乱，可能是JS产区酒样中存在部分年份白酒，放置一段时间后风味物质含量发生了改变。据文献报道，金沙地区酱香白酒分布较为集中，茅台镇核心地区、习水地区分布聚拢，这可能是因为金沙酱酒与其他几个地区酱香白酒的矿质含量有差异[17]。由此可见，JS与LJ产区酒样组间差异大，与其余三个产区分布明显区分开，XJ、MT和ZJ三个产区酒样的风味物质分布较一致的原因可能是地理位置接近，环境条件以及微生物种类较相似。

图2 不同产区酒样挥发性风味物质主成分分析散点图Fig.2 Scatter plots of principal component analysis of volatile flavor compounds in Baijiu samples from different producing regions

2.2.2 模型构建及验证

总体来看，虽然五个产区白酒大致被区分开，但组间和组内之间分布都较为散乱，为建立一个快速准确的赤水河流域产区鉴别模型，采用Hotelling's T2和DmodX法排除异常值，主成分分析的异常值筛选见图3。由图3可知，排除异常值15个，剩下116个训练集、15个测试集基于挥发性风味物质含量结果对不同赤水河流域产区酱香型白酒构建模型。

图3 主成分分析的异常值筛选Fig.3 Abnormal value screening of principal component analysis

筛选完异常值后，将剩余训练集样品的挥发性风味化合物定量结果构建OPLS-DA模型，结果见图4。由图4可知，MT产区酒样基本与XJ和ZJ产区酒样分离开，但XJ和ZJ产区酒样分离效果依然不佳。总体来说模型分类良好，且模型的解释变量（R2Y）和预测能力（Q2Y）分别为0.966和0.945。

图4 不同酒样挥发性风味化合物正交偏最小二乘-判别分析Fig.4 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis of volatile flavor compounds in different Baijiu samples

此外进行了200次的置换检验，结果见图5。由图5可知，置换检验的R2截距为0.926，Q2截距为-0.454，且图中左侧的点均低于右侧的点，说明模型对数据未过拟合。

图5 置换检验结果Fig.5 Results of the permutation test

将从每个产区随机抽取三个观测值作为测试集代入上述模型中，以评估模型对于不同产区的识别情况，五个不同产区的训练集和测试集在两个模型中的分布情况见图6。由图6可知，大多数酒样正确分布到相应的区域，个别酒样除外。

图6 测试集酒样分布Fig.6 Distribution of test set Baijiu samples

2.3 差异挥发性风味化合物的筛选

VIP值可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献度[18]，VIP值越大，认为变量在不同产地间差异越显著[19]，以VIP值＞1为筛选标准，确认了28种对赤水河流域不同产区白酒具有贡献的物质。赤水河流域不同产区酱香型白酒风味物质VIP分布图见图7。

图7 基于正交偏最小二乘-判别分析不同酒样挥发性风味物质变量投影重要性值Fig.7 Variable importance in the projection values of volatile flavor compounds in different Baijiu samples based on orthogonal partial least squares-discriminant analysis

由图7可知，28种对赤水河流域不同产区白酒具有贡献的物质为2-丁基呋喃、壬酸乙酯、癸酸、2-壬酮、乳酸乙酯、仲丁醇、乙酸、乙偶姻、肉豆蔻酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪、癸酸乙酯、异戊醛、乙酸乙酯、己醛、2,3,5-三甲基吡嗪、辛酸乙酯、正丙醇、邻苯二甲酸二丁酯、异戊醇、异丁醛、2-戊醇、苯乙酸乙酯、2-壬醇、庚酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸、糠醛、丁酸。其中，2-丁基呋喃（1.60）、壬酸乙酯（1.40）、癸酸（1.30）对区分不同产区酒样贡献度更大。

为进一步探索赤水河流域不同产区酱酒风味差异物，根据VIP值筛选出来的28种潜在差异物绘制聚类热图，直观展示了64种挥发性风味成分在不同产区间的分布规律，结果见图8。由图8可知，不同产区的酒样之间分类效果较好，LJ和JS产区酒样明显区分于其他三个酒样，MT、ZJ和XJ产区酒样风格类似，其中MT和ZJ产区酒样聚类效果更佳。不同产区酱香白酒中的关键差异物是造成不同酒样品质风格不同的主要原因，五个产区被分成不同类别，进一步验证了赤水河流域不同酱香白酒产区风格差异显著性。

图8 不同酒样挥发性风味化合物的聚类分析热图Fig.8 Heat map of cluster analysis of volatile flavor compounds in different Baijiu samples

其中庚酸乙酯、辛酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、己酸在LJ和JS产区酒样含量明显高于其他三个产区，根据定量结果可知，LJ和JS产区酒样的己酸乙酯含量偏高，己酸乙酯是浓香型白酒中酯类物质含量最高的物质，在LJ产区酿造环境和酿造工艺中存在一些己酸乙酯的代谢物，这与唐平等[20-21]研究结果一致。JS产区酒样的异丁醛、异戊醛、糠醛和异戊醇含量较高，糠醛是酱酒中的主要呋喃类物质，高沸点、不易挥发，具有空杯留香的特点，其在JS产区酒样中的含量远远高于其他产区，JS酱酒浓郁的空杯香很有可能就是高含量、高沸点的糠醛与其他香气物质形成的复合香气。这与周靖等[22]对金沙酱酒风味研究研究结果一致，XJ产区酒样中的乙酸和乙酸乙酯含量最高，乙酸是白酒中最丰富的酸，具有酸香和醋香气味，它由酵母菌在发酵过程中产生[23]，脂肪酸通过酯类水解来促进XJ产区酒样的香气平衡，这对芳香酯含量有重要影响。MT产区酒样的吡嗪类物质含量相对于其他产区而言较高，大部分吡嗪类物质对人体健康有益，吡嗪类物质是酱香白酒焦香风味的主要来源[24]。异戊醛、异戊醇、丁酸乙酯、糠醛对JS产区酒样贡献较大，这与张情亚等[25]研究结果一致。

3 结论

本研究围绕了赤水河流域中的JS、LJ、ZJ、MT、ZJ五个不同产区代表性的52个样品酱香型白酒中的64种挥发性物质定量结果进行分析。主成分分析结果显示，JS产区和LJ产区酒样明显与其他产区酒样分开，ZJ、XJ产区酒样聚集度较高，MT产区酒样靠近ZJ和XJ产区酒样，总体来说，五个产区的酱香白酒风味分布有一定的差异性。利用PCA和OPLS-DA建立赤水河流域不同酱香白酒产区分类模型，部分酒样作为验证模型，模型预测率为100%，基本可以实现不同产区的酱香白酒鉴别。根据VIP值筛选出的28种重要差异物做聚类分析热图以直观表达不同流域产区白酒风味成分分布规律，结合载荷图和OAV分析最终确立了19个对贵州不同产区风味物质差异具有贡献的物质，包括6种酯类、3种酸类、2种醛类、3种醇类、2种吡嗪类、1种呋喃类、2种芳香族类物质。本研究可对赤水河不同流域产区白酒风味差异提供一定的数据和理论支持，丰富了不同产区白酒的地理环境存在差异，为了建立更具实用价值、更稳定的白酒判别模型，还需扩大采样范围和样本量进行更深层次的研究。