橄榄果酒发酵工艺优化与挥发性风味物质分析

王 宏，黄炳旗，刘功良，肖更生，赵文红，李学莉，白卫东*

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院 广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室 现代农业工程创新研究院，广东 广州 510225；2.东鹏饮料（集团）股份有限公司，广东 深圳 518055）

橄榄（Canarium album），又称青果，是橄榄科橄榄属植物，主要分布在广东、福建、广西等省，具有悠久的食用和药用历史。橄榄富含多酚、类黄酮、膳食纤维、矿物质等营养成分，具有抗氧化[1]、抗神经炎症[2]、调节肠道微生物[3]、防止肥胖症[4]等多种生物活性，逐渐受到食品、医药和保健行业的重视，已被我国卫生健康委员会列入药食同源目录[5]。目前，橄榄产业存在科技创新不足、采后商品化和深加工滞后、市场开发不足、品牌建设乏力等问题[6]，不利于橄榄产业的精深加工开发和全面发展。使用有效的加工技术和方法对橄榄进行加工，在保留橄榄果的营养价值的同时，又能改善产品的功能特性，提升橄榄的加工利用价值，是橄榄加工产业的新热点。

橄榄除了鲜食之外，还可制作成果汁饮料[7-8]、果醋[9]、果酒[10-11]等形式在市场进行销售。其中，果酒可以极大地保留果实中原有的营养物质，具有多种生理活性[12]。因此，利用橄榄果实通过发酵生产橄榄果酒，不仅能有效保留果实中原有的营养物质[13]，而且丰富并增加了其他营养成分及保健功能[14]。对橄榄果酒发酵工艺进行优化，极大地保留橄榄中的多酚类物质、维生素C等生物活性成分[15-18]，同时对其特征成分和风味进行分析，开发一款符合大众口味的低醇度高营养价值的橄榄果酒，一方面可以为橄榄果酒的研究提供理论基础，另一方面可以为橄榄果酒的加工生产及应用提供新的指导方向。

本研究以橄榄果为原料，研制橄榄发酵型果酒。首先筛选出橄榄果酒最适发酵菌种，再通过单因素和正交试验对橄榄果酒的工艺进行优化，并对最优工艺下的橄榄果酒中多酚、维生素C、挥发性风味物质等特征成分进行分析，以期为橄榄果酒的开发与利用提供理论参考，也为橄榄果酒的产业化发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橄榄果（广东檀香1号）：购自潮州市文祠镇；食用小苏打、白砂糖：市售；EX-V果胶酶（活性和广谱边缘酶活性）、DV10酵母：法国拉曼集团；SY酵母、BA酵母、RV171酵母、BV818酵母：安琪酵母股份有限公司；偏重亚硫酸钾、氢氧化钠标准滴定溶液、酚酞指示液（10 g/L）、福林酚、没食子酸标准品、抗坏血酸标准品、二氯靛酚、葡萄糖（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸、氯化钠、碳酸氢钠（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-6同步搅拌水浴锅：上海赫田科学仪器有限公司；BSP生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZQZY-98CES培养箱：上海知楚仪器有限公司；P901酸度计：上海佑科仪器仪表有限公司；SOP电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LB50T糖度计：广州速为电子科技有限公司；5977B-8890气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）仪：美国安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 橄榄果酒发酵工艺流程及操作要点

橄榄果挑选→橄榄前处理（洗涤、去核、破碎）→调整成分→菌种活化→控温发酵→灭菌→过滤→橄榄果酒

橄榄果挑选：挑选表皮完整、无破损、呈鲜绿或者淡绿色的橄榄果。

橄榄前处理：将橄榄洗净放入容器内，按照一定的料液比添加水，将橄榄破碎到一定程度后，迅速转移至250 mL锥形瓶中。

调整成分：分别加入橄榄与水总质量（或果浆总质量）0.02%的C-MAX果胶酶和0.02%的偏重亚硫酸钾，使用白砂糖调整发酵液糖度为33°Bx，充分搅拌，使用小苏打将待发酵液初始pH调节至4.5。

菌种活化、控温发酵：将DV10酵母和水按照比例1∶10（g∶mL）进行混合，37 ℃活化15 min。再按照一定接种量接种到橄榄果浆中，使用封口膜进行密封，放入恒温培养箱中在一定温度条件下进行发酵，使用糖度计对糖度变化进行监测，待橄榄果酒中糖度不再下降时，即认为橄榄果酒发酵结束。

灭菌、过滤：将发酵好的橄榄果酒75 ℃灭菌5 min，把灭菌好的橄榄果酒使用3～4层121 ℃灭菌15 min后的纱布过滤，收集滤液至锥形瓶中，使用封口膜进行密封，4 ℃冰箱中冷藏。

1.3.2 最优菌种的筛选

选取BV818、SY、DV10 3种酵母作为考察菌种，控制橄榄果破碎程度为90%，料液比为1∶4（g∶mL），3种酵母添加量为0.05%，发酵液糖度为33°Bx，发酵温度24 ℃。通过基础工艺条件制作橄榄果酒，并记录发酵过程中的糖度变化、酒精度和感官评分。

1.3.3 橄榄果酒发酵工艺优化单因素试验

设定橄榄果破碎程度为90%，料液比为1∶4（g∶mL），发酵温度24 ℃为基础条件，改变单一条件，以橄榄果酒酒精度和感官评分作为评价指标，分别考察破碎程度（0、30%（颗粒大小为10 mm×5 mm）、60%（5 mm×2 mm）、90%（＜1 mm×1 mm）），料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL）），发酵温度（16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃）对橄榄果酒发酵的影响。

1.3.4 橄榄果酒发酵工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，以橄榄果破碎程度（A）、料液比（B）、发酵温度（C）为因素，以橄榄果酒酒精度和感官评分为评价指标，设计3因素3水平L9（33）正交试验，正交试验因素与水平见表1。

表1 橄榄果酒发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization of olive wine

1.3.5 测定方法

（1）感官评价

选择10位经过培训并具备食品专业知识的感官评价人员，从外观、香气、口感和典型性4个方面对橄榄果酒进行感官评分，取10人平均分，满分为100分。感官评分标准见表2。

表2 橄榄果酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of olive wine

（2）理化指标测定

糖度：采用糖度计法；酒精度、总酸、还原糖、维生素C：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法、电位滴定法、直接滴定法和2,6-二氯靛酚滴定法；总酚：采用福林酚法[19]并稍作修改，福林酚试剂添加量为1 mL，10%碳酸钠与福林酚用量比例为3∶1，反应时间为30 min。

（3）挥发性风味物质的测定

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法（headspacesolid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）测定橄榄果酒挥发性风味物质。将萃取针（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）于250 ℃条件下活化10min，备用。吸取7 mL发酵液于15 mL样品瓶中，加入NaCl 1.4 g和磁力转子，盖上铝盖；然后将样品置于磁力搅拌加热器上，45 ℃预热5 min；插入已活化的萃取针，吸附萃取50 min；随即将萃取针插入GC-MS仪器进样口中，250 ℃解吸5 min。

GC条件：采用DB-WAX UI色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。进样口温度250 ℃，进样模式为不分流，以高纯氦气（He）作为载气。柱温箱升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升温至100 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升温至200 ℃，保持10 min。

MS 条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；采集模式为全扫描；质量扫描范围50～550 m/z。

定性定量方法：选取匹配度≥70%的物质，通过美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14谱库与挥发性化合物谱图进行比对，结合相关资料及文献进行分析和鉴定进行定性；采用面积归一法进行定量[20]。

1.3.6 数据分析

试验结果以“平均值±标准差”（n=3）的形式表示。采用JMP13进行数据显著性分析，P＜0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 酵母菌种类型对橄榄果酒发酵的影响

酵母菌菌种类型对橄榄果酒发酵的影响见表3。由表3可知，3种酵母菌发酵制备的橄榄果酒酒精度及残糖均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中规定的范围；DV10酵母发酵制备的橄榄果酒感官评分最高（74.53分）且较另外两种酵母发酵周期缩短，表现出最高的活性，因此后续试验将选用DV10酵母发酵橄榄果酒。

表3 酵母菌种类型对橄榄果酒发酵的影响Table 3 Effect of yeast type on the fermentation of olive wine

2.2 橄榄果酒发酵工艺优化单因素试验

2.2.1 破碎程度对橄榄果酒发酵的影响

由图1可知，随着橄榄果破碎程度的提高，橄榄果酒酒精度、感官评分均呈先上升后趋于平缓的趋势。橄榄果破碎程度为90%时，橄榄果酒的酒精度、感官评分均最高，分别（13.43±0.47）%vol和（62.67±1.53）分。可能是因为当橄榄果为破碎程度为90%时，橄榄果肉中的风味物质更容易析出到酒体中，丰富了橄榄果酒的风味成分，从而提高了橄榄果酒的感官效果。因此选择橄榄果的最佳破碎程度为90%。

图1 破碎程度对橄榄果酒品质的影响Fig.1 Effect of crushing degree on the quality of olive wine

2.2.2 料液比对橄榄果酒发酵的影响

由图2可知，随着料液比的增加，橄榄果酒酒精度、感官评分均呈先下降后上升再下降的趋势。当料液比为1∶4（g∶mL）时，橄榄果酒的酒精度、感官评分均达到最高，分别为（16.00±0.17）%vol、（75.60±2.31）分；在料液比为1∶2～1∶4（g∶mL）时，随着果肉的减少，橄榄果肉本身的涩味减少，果香味趋于合适，使得果酒口感得到提升，因此感官评分呈上升趋势；料液比在1∶4（g∶mL）之后，随着果肉减少，橄榄果本身的特殊风味被淡化，影响橄榄果酒的整体风味，使得感官评分下降；当料液比为1∶6（g∶mL）时，感官评分呈现出一定的上升趋势，但该料液比下的橄榄特征风味淡薄，酒香掩盖了果香，无果酒本身的清爽口感。因此选择最佳料液比为1∶4（g∶mL）。

图2 料液比对橄榄果酒品质的影响Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on the quality of olive wine

2.2.3 发酵温度对橄榄果酒发酵的影响

由图3可知，随着发酵温度的升高，橄榄果酒酒精度、感官评分均呈先上升后下降的趋势，在发酵温度为24 ℃时，橄榄果酒的酒精度、感官评分均达到最高，分别为（15.13±0.64）%vol、（74.53±3.72）分；在发酵温度为16～24 ℃时，随着发酵温度的升高，酒精度与感官评分都与温度呈现正相关关系，此时酵母在低温下生长速度较慢，导致发酵不彻底，因此酒精度不高；当温度超过24 ℃时，随着温度的升高，橄榄果酒的酒精度与感官评分都呈现快速下降的趋势。综上，认为发酵温度对橄榄果酒的发酵品质具有较大的影响，最佳发酵温度为24 ℃。

2.3 橄榄果酒发酵工艺优化正交试验

由表4可知，在3种影响橄榄果酒发酵的因素中，按照各因素对感官评分的影响，从大到小依次是破碎程度（A）＞发酵温度（C）＞料液比（B）。通过计算K值，可知最优发酵工艺组合为A3B1C3，即橄榄果酒最优工艺参数为破碎程度为90%、料液比为1∶3（g∶mL）、发酵温度为28 ℃。

2.4 验证试验及果酒品质分析

为验证所得结果的正确性，在最优工艺参数组合下进行3次重复试验。结果表明，在最优工艺下酿造的橄榄果酒感官评分为（91.83±0.67）分，具有较浓郁的橄榄果香与酒香，色泽金黄，清亮透明，口感圆润醇厚、回味绵延。经测定，橄榄果酒酒精度为（15.03±0.4）%vol，总酚含量为（27.76±0.36）g/L，总酸含量为（5.00±0.13）g/L，还原糖含量为（2.53±0.09）g/L，维生素C含量为（30.49±3.10）mg/L，符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求。

2.5 橄榄果酒挥发性风味物质分析

通过HS-SPME-GC-MS测定橄榄果酒中挥发性风味物质，结果见表5。由表5可知，从橄榄果酒中共检测出38种挥发性物质，包括9种醇类，相对含量为46.48%；酯类13种，相对含量为4.01%；醛类5种，相对含量为1.79%；酮类1种，相对含量为0.11%；酸类2种，相对含量为0.57%；酚类2种，相对含量为2.06%；烃类1种，相对含量为0.18%；烯烃类3种，相对含量为0.13%；萜烯1种，相对含量为0.32%；其他类型挥发性风味物质1种，相对含量为0.15%。其中，橄榄果酒中主要的挥发性风味物质为醇类和酯类，共同构成橄榄果酒特殊风味的基础[21-23]。

表5 橄榄果酒挥发性风味物质检测结果Table 5 Determination results of volatile flavor components in olive wine

醇类物质为橄榄果酒中含量最高的挥发性风味物质。这些醇类物质可赋予橄榄果酒不同的香味，如苯乙醇能赋予橄榄果酒清甜的玫瑰花香、蜂蜜味与蔷薇花香，能赋予橄榄果酒独特的香气，对酒的香气形成具有积极作用[24-25]；异戊醇微甜带苦，能赋予橄榄果酒独特的苦杏仁味[26]；辛醇能赋予果酒茉莉与柠檬的香味[27]。各种高级醇相互协调，使得橄榄果酒的口感更加丰满，丰富了橄榄果酒的酒香。

酯类物质为橄榄果酒中种类最丰富的挥发性风味物质，这类物质既呈香又呈味，是橄榄果酒中重要的挥发性风味物质。本研究共检测出13种酯类物质，其中，乙酸乙酯的浓度最高，其次是辛酸乙酯。这些酯类物质可赋予果酒不同香味，如辛酸乙酯可赋予橄榄果酒令人愉快的花果香气及白兰地酒香气[28]；癸酸乙酯可赋予果酒李子花香和果香[29]。各种酯类物质的香味相互协调、融合，丰富了橄榄果酒的风味。

醛类、酚类、酮类和酸类物质在橄榄果酒中的含量较少。其中，苯甲醛可赋予橄榄果酒樱桃与坚果香，这种物质也同样存在于白兰地中，是重要的香气物质[30]；辛酸可赋予橄榄果酒草莓味、桃子味等多种果味。这些物质对于橄榄果酒风味的形成具有促进作用，丰富了橄榄果酒整体的风味。

3 结论

本研究以橄榄鲜果为原料，对橄榄果酒的工艺、品质及风味进行探究，分析了酵母菌种、破碎程度、发酵温度及料液比对橄榄果酒的影响，通过正交试验得到橄榄果酒最佳发酵工艺条件为破碎程度90%、料液比为1∶3（g∶mL）、发酵温度为28 ℃。在最优工艺条件下得到的橄榄果酒，感官评分为（91.83±0.67）分，色泽呈现出金黄色、清亮透明，果香与酒香协调，口感圆润醇厚、回味绵延，具有橄榄的典型风味。橄榄果酒中总酚含量为（27.76±0.36）g/L、总酸含量为（5.00±0.13）g/L、还原糖含量为（2.53±0.09）g/L、维生素C含量为（30.49±3.10）mg/L，共检测出38种挥发性风味物质，赋予了橄榄果酒特殊的果酒风味。本研究在橄榄果酒发酵工艺参数方面具有一定的创新性和实用价值，研究结果为橄榄果酒的研发、加工与生产提供了新的指导方向，为橄榄精深加工产品开发提供思路。