二代测序技术检测高血压性脑出血合并颅内感染患者脑脊液病原菌动态变迁情况

杨 景, 张 伟, 方 宜, 李中柱, 王咏雪

岳阳市中心医院1.感染性疾病科;2.骨科;3.呼吸与危重症医学科,湖南 岳阳 414000

开颅手术是临床治疗高血压性脑出血(hypertensive cerebral hemorrhage,HICH)的重要手段,术后颅内感染是其常见并发症之一,发生率约为0.3%～1.5%[1-2]。脑脊液标本的病原菌培养和耐药分析对临床制定合理抗菌药物使用方案具有重要指导意义,但仍存在培养时间长、假阴性率高、无法定量、无法检测胞内菌、寄养菌等显著缺点[3-4]。二代测序技术是一种无需培养病原体的新型检测方法,可直接提取DNA/RNA后进行病原测序,并经由生物信息学分析后获取相关定量数据,如病原体覆盖度、序列数等,可快速识别病原微生物,具有准确、快速、全面及无偏性识别多种病原体等显著优势[5]。本研究基于二代测序技术对HICH合并颅内感染患者的脑脊液病原菌分布情况进行分析,旨在为临床制定合理的抗菌药物治疗方案提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2019年3月至2022年12月岳阳市中心医院收治的513例HICH患者为研究对象。纳入标准:符合《高血压性脑出血中国多学科诊治指南》[6]相关标准;具有手术指征,接受开颅手术;病历资料完整。排除标准:术前合并免疫缺陷疾病或感染性疾病者;合并恶性肿瘤者;伴有严重心、肝、肾功能障碍者;存在手术用药物过敏史者。根据颅内感染严重程度将82例HICH合并颅内感染患者分为轻度感染组(n=28)、中度感染组(n=36)与重度感染组(n=18)。轻度感染组:男性15例,女性13例;年龄46～69岁,平均年龄(54.32±6.43)岁。中度感染组:男性19例,女性17例;年龄46～69岁,平均年龄(55.65±5.64)岁。重度感染组:男性9例,女性9例;年龄43～70岁,平均年龄(56.69±4.65)岁。3组患者一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。所有患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集与检测 应用无菌技术采集患者2～5 ml脑脊液。采用二代测序技术进行检测,具体如下。取3 ml脑脊液样本,离心处理后提取DNA。应用gilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段大小,通过Qubit dsDNA HS Assay Kit对DNA文库浓度进行质控,经滚环复制后生呈DNA纳米球。将制备完成的DNB纳米球加载至测序芯片,通过BGISEQ-50/MGISEQ-2000进行测序。通过Burrows-Wheeler Aligner软件比对去除高质量数据中人参考基因组序列数据,再将剩余数据中的低复杂度reads去除,而后与真菌、专用细菌、病毒、寄生虫4个微生物大数据库进程比对,获取可匹配的病原体序列,判断可能的病原体。

1.2.2 耐药性检测 对82例HICH合并颅内感染患者的脑脊液样本进行分离培养与药敏试验。采用K-B纸片扩散法进行检测,根据标准操作对结果进行判读。

1.2.3 氧化应激指标及炎性因子的检测 采集所有患者空腹肘静脉血2 ml,经离心取清液。采用酶联免疫法检测血管紧张素Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)及降钙素原(procalcitonin,PCT),试剂盒均购自上海酶联生物科技公司。

2 结果

2.1 HICH患者脑脊液分离情况统计 513例HICH患者脑脊液标本中,共分离出3 391株病原菌。其中,2 385株(70.33%)为革兰阳性菌,1 006株(29.67%)为革兰阴性菌。见表1。

表1 HICH患者脑脊液分离情况统计/例(百分率/%)

2.2 HICH合并颅内感染患者脑脊液中主要革兰阳性菌耐药特点 82例HICH合并颅内感染患者的脑脊液样本中,共分离出致病菌126株。其中,革兰阳性菌检出72株,检出率为57.14%(72/126),以凝固酶阴性葡萄球菌34株(47.22%)、金黄色葡萄球菌24株(33.33%)和粪肠球菌14株(19.44%)为主。凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌对青霉素的耐药性均达到100.00%,但对万古霉素均无耐药性。见表2。

表2 HICH合并颅内感染患者脑脊液中主要革兰阳性菌耐药特点/例(百分率/%)

2.3 HICH合并颅内感染患者脑脊液中主要革兰阴性菌耐药特点 分离的126株致病菌中,革兰阴性菌54株(42.86%),主要为铜绿假单胞菌25株(46.30%)、鲍曼不动杆菌15株(27.78%)和肺炎克雷伯菌14株(25.93%)。铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南均无耐药性。见表3。

表3 HICH合并颅内感染患者脑脊液中主要革兰阴性菌耐药特点/例(百分率/%)

2.4 各组患者氧化应激指标及炎性因子水平比较 中度感染组、重度感染组患者MDA、Ang-Ⅱ、PCT、CRP均高于轻度感染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组患者氧化应激指标及炎性因子水平比较

3 讨论

脑出血是一种自发性、非外伤性的常见脑血管疾病,约占卒中的10%～30%,主要由脑实质内血管破裂所致[7-8]。手术是临床治疗脑出血的常用手段,疗效显著,但患者术后极易出现颅内感染等并发症,影响其术后康复效果。谢武表等[9]研究发现,抗菌药物治疗可显著降低感染发生率。目前,抗菌药物治疗仍是治疗颅内感染的重要措施,但经验性用药容易导致病菌产生耐药性,使得临床治疗难度显著提升[10-11]。因此,针对致病菌的耐药特点,选择合适的抗生素,对改善患者病情至关重要[12-14]。

本研究结果显示:513例HICH患者脑脊液标本中,共分离出3 391株病原菌;2 385株(70.33%)为革兰阳性菌,1 006株(29.67%)为革兰阴性菌。这提示,病原菌感染在神经外科患者中高发,以革兰阳性菌占主导地位。开颅术后颅内感染具有高发性,需要采取有效的预防和治疗措施[15-17]。本研究结果显示:凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌对青霉素的耐药性均达到100.00%,但对万古霉素均无耐药性;铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南均无耐药性。这提示,凝固酶阴性葡萄球菌已成为医院感染最常见的病原菌之一,不同病原菌对机体耐药机制存在差异性。高耐药性菌株的存在凸显了目前抗菌药物耐药性的严峻形式,需要更深入的研究和监测来应对这一挑战[18-20]。在治疗术后颅内感染时,需要综合考虑药物的耐药性和患者的具体情况,选择合适的抗菌药物。此外,中度感染组、重度感染组患者MDA、Ang-Ⅱ、PCT、CRP均高于轻度感染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。这提示,检测HICH患者血清中的Ang-Ⅱ、PCT、MDA、CRP水平对诊断HICH术后颅内感染具有一定的辅助价值,为临床决策提供额外支持。

综上所述,HICH合并颅内感染病原菌种类较多,定期对病原菌构成和药敏情况进行分析,并结合检测血清Ang-Ⅱ、MDA、PCT、CRP水平,有利于为临床早期抗感染治疗、合理选择抗生素提供理论依据。