人呼吸道合胞体病毒感染细胞中长链非编码RNA差异表达情况观察及生物学功能分析

欧阳静, 彭 双, 谭英征, 周 慧

1.株洲市中心医院 感染内科,湖南 株洲 412000;2.株洲恺德心血管病医院 神经内科,湖南 株洲 412000

人呼吸道合胞体病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)是由单股负链RNA构成的一种肺炎病毒科病毒,是导致婴幼儿、老年人及免疫缺陷患者发生下呼吸道感染的重要病因,该病毒感染后容易导致患者出现支气管或肺功能发生改变,严重影响患者生命健康[1]。在病毒感染过程中,宿主细胞可以通过模式识别受体对病毒相关分子模式进行监测,然后启动天然免疫反应,并通过分泌产生干扰素等细胞因子杀灭病毒,但RSV能通过多种免疫逃逸机制产生细胞感染和遗传物质复制[2-3]。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)不具备蛋白质编码功能,但能调控基因表达,从转录及转录后调控、表观遗传学等方面调节基因表达过程[4]。本研究旨在观察RSV感染的A549细胞中lncRNA的差异表达情况,并分析其生物学功能,以期为从lncRNA角度认识RSV及其与A549宿主细胞之间的相互作用提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与病毒感染 人肺部细胞系A549、Calu-1、HCC827、MRC-5、HFL1细胞购自尚恩生物,采用DMEM培养液(美国Gibco)进行细胞培养,加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),置于37℃、5%CO2培养箱中培养,当人肺部细胞系生长至80%密度,PBS洗涤3次,采用感染复数为1的RSV感染肺部细胞系,1 h后加入DMEM维持液(含2% FBS),继续放置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2 RNA提取及lncRNA基因芯片检测 RSV感染A549细胞24 h后,提取总RNA,采用NanoDropND-1000(美国Thermo)检测总RNA浓度,并采用琼脂糖凝胶电泳对RNA完整性进行检测。然后采用Agilent lncRNA Human Gene Expression Microarray version基因芯片检测lncRNA表达谱,采用Agilent Feature Extraction software进行图像分析。当P<0.05且相对表达量变化倍数>2时,认为lncRNA存在显著差异,然后采用Cluster 3.0继续进行层次聚类分析。

1.3 lncRNA靶基因的GO和KEGG功能富集分析 对存在差异表达的lncRNA相关靶基因进行GO和KEGG Pathway富集分析,分析lncRNA靶基因可能参与的细胞通路及潜在疾病类型、生物学功能。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应法验证 将RSV接种于人肺部细胞系并发生感染24 h后对细胞进行收集处理,加入TRIzol试剂将细胞完全裂解,然后使用Prime Script RT reagent Kit反转录试剂盒将总RNA进行反转录。聚合酶链反应条件:95℃ 15 min,95℃ 15 s,60℃ 20 s,连续循环40次。最后均采用2-△△ct计算lncRNA相对表达量。

2 结果

2.1 RSV感染A549细胞后的lncRNA差异表达 A549细胞感染RSV后共计2 415个lncRNA发生差异表达,包括1 453个上调lncRNA和962个下调lncRNA,前10个上调和下调最显著的lncRNA见表1。其中,上调和下调最多的lncRNA分别为ENST00000607613.1[差异倍数(fold change,FC)=165.687]和ENST00000520156.1(FC=23.562)。RSV感染A549细胞后的lncRNA差异表达整体分布火山图和聚类分析见图1和图2。

图1 RSV感染A549细胞后的lncRNA差异表达整体分布火山图(蓝点代表非显著差异表达的lncRNA,红点、绿点分别表示发生上调、下调且存在显著表达差异的lncRNA)

图2 RSV感染A549细胞后的lncRNA差异表达聚类分析(红色、绿色分别表示发生上调、下调且存在显著表达差异的lncRNA)

表1 RSV感染A549细胞后的lncRNA上调和下调表达结果

2.2 GO和KEGG富集分析 GO富集分析显示,差异表达的lncRNA调控靶基因主要与干扰素(Ⅰ型)信号转导、宿主抗病毒反应、病毒基因组复制的负调控等免疫反应生物学过程高度相关。进一步的pathway富集分析结果显示,差异表达的lncRNA主要调控干扰素信号转导途径、免疫及炎症等信号通路。差异表达lncRNA调控的mRNA靶基因的GO功能富集结果和KEGG功能富集结果见图3和图4。

图3 差异表达lncRNA调控的mRNA靶基因的GO功能富集结果

图4 差异表达lncRNA调控的mRNA靶基因的KEGG功能富集结果

2.3 实时荧光定量聚合酶链反应验证分析 生物信息学分析结果显示,18种lncRNA(P17101、P7539、P8209、P25918、P38638-v4、P8612、P8610、P34527-v4、P6011、P4480、P13713、殖及干扰素调节过程具有高度相关性。提取RSV感染的A549细胞RNA并进行实时荧光定量聚合酶链反应验证发现,18种lncRNA相对表达水平分析结果与表达谱数据一致。见图5。在人肺部细胞Calu-1、HCC827、MRC-5、HFL1中18种lncRNA相对表达水平的上升或下降与A549细胞一致。见图6。

图5 18种显著差异表达lncRNA的实时荧光定量聚合酶链反应验证结果

图6 18种显著差异表达lncRNA在其他人肺部细胞的实时荧光定量聚合酶链反应验证结果

P9969、P11891、P34635-v4、P12897、P8069、P3377、P30240)存在显著差异表达,且上述存在差异表达的lncRNA与RSV繁

3 讨论

在RSV感染宿主细胞过程中发生着广泛的蛋白质组学和转录组学的变化,上述变化直接或间接介导并参与宿主对RSV感染的适应性免疫反应和固有免疫反应;同时,RSV可以通过黏膜糖蛋白、融合糖蛋白、基质蛋白和非结构蛋白(nonstructural protein,NS)等多种方式和途径规避宿主对其产生的应激反应[5-6]。RSV与宿主之间的相互作用对于抗RSV药物以及相关疫苗的开发具有关键性的指导意义,但既往研究中关于两者之间的相互作用更多集中于RSV与宿主蛋白质的相互关系[7],关于RSV与宿主之间的相互作用尚且需要进一步深入研究。

lncRNA作为非编码RNA分子,在基因重组、蛋白质转录和翻译等生理过程中发挥重要作用,与多种疾病密切相关[8-9],特别是lncRNA的异常表达是导致疾病发生和发展的重要原因。有研究证实,lncRNA在疱疹病毒等DNA病毒、乙肝病毒等RNA病毒与宿主之间的相互作用中发挥重要调控作用[10]。当RSV感染宿主细胞后,宿主细胞lncRNA表达水平可发生差异化表达,进而通过调控特异性蛋白的编码基因而干扰病毒复制过程。本研究结果显示:A549细胞感染RSV后共计2 415个lncRNA发生差异表达,包括1 453个上调lncRNA和962个下调lncRNA,其中,上调和下调最多的lncRNA分别为ENST00000607613.1(FC=165.687)和ENST00000520156.1(FC=23.562);进一步的生物信息学分析结果证实,上述差异表达的lncRNA主要调控干扰素信号转导途径、免疫及炎症等信号通路,且上述结果经实时荧光定量聚合酶链反应验证得以证实;GO和KEGG功能富集分析发现,差异化表达的lncRNA主要富集在宿主抗病毒反应、干扰素(Ⅰ型)信号转导、病毒基因组复制的负调控等免疫反应生物学过程。这提示,在RSV感染A549细胞后,免疫反应相关基因在病毒感染及拮抗反应过程中发挥关键作用。关于lncRNA在细胞中功能的发挥,邵冰等[11]研究发现,mRNA和lncRNA均可作为竞争性内源性RNA,与miRNA位点结合,从而相互调节,进而推测lncRNA也可能通过内源竞争性方式调控相关基因表达。多项研究证实,RSV NS1和NS2能够通过降低肿瘤坏死因子受体相关因子3蛋白表达量发挥Ⅰ型干扰素分泌抑制作用[12-13]。刘美琴等[14]通过采用互补siRNA对A549细胞中的lncRNA P3377和P8610进行敲低研究发现,RSV感染的A549细胞中的BST2和OAS2靶基因表达量明显降低,表明lncRNA P3377对靶基因OAS2和BST2存在明显正向调节功能,进而抑制RSV复制,发挥宿主抗病毒抑制作用。

综上所述,RSV感染A549细胞后,lncRNA表达谱产生显著变化,差异化表达的lncRNA主要通过炎症反应和干扰素信号转导途径参与细胞对病毒感染的反应调控过程。