转化生长因子β活化激酶1在骨性关节炎中的表达及作用

崔道然 金胡日查 杨健 崔志明

[摘   要]   目的：研究轉化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor-β activated kinase 1，TAK1）在骨性关节炎中的表达及其作用。方法：收集20例全膝关节置换或截肢术患者手术标本，分为正常组8例和退变组12例。对标本切片进行病理观察和OARSI关节软骨退变评分，免疫组化法检测软骨细胞中TAK1的表达。建立TNF-α（20 ng/mL）诱导的软骨细胞凋亡模型，采用TUNEL检测软骨细胞凋亡，Western Blot检测TNF-α诱导不同时间TAK1和活化Caspase-3的表达水平，免疫荧光染色显示TAK1和活化Caspase-3在软骨细胞中的定位，观察转染siRNA抑制TAK1表达对活化Caspase-3表达的影响。结果：手术标本切片显示，退变组软骨表面出现较深裂隙，细胞体积缩小，大量软骨细胞坏死。退变组OARSI评分3.50±1.00分，明显高于正常组的0.50±0.54分，差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组化显示，退变组TAK1阳性细胞77.28%，高于正常组的15.35%，差异有统计学意义（P<0.05）。Western Blot检测显示，软骨细胞在TNF-α诱导0 h TAK1低表达，诱导后12 h TAK1表达开始上调，36 h达到峰值，诱导后12 h、24 h、36 h、48 h TAK1表达水平高于0 h，差异均有统计学意义（P<0.05）。活化Caspase-3表达在诱导12 h开始上调，24 h达到峰值，差异均有统计学意义（P<0.05）。TNF-α诱导后TUNEL阳性细胞数明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光染色显示，TAK1和活化Caspase-3在TNF-α诱导的软骨细胞中共定位。siRNA转染沉默TAK1后活化Caspase-3表达增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：TAK1在骨性关节炎中表达上调，可能通过抑制Caspase-3的表达而发挥抑制软骨细胞凋亡的作用，在骨性关节炎进展过程中具有重要意义。

[关键词]   转化生长因子β活化激酶1；Caspase-3；骨性关节炎；软骨细胞；凋亡

[中图分类号]   R684.3 [文献标志码]   A [DOI]   10.19767/j.cnki.32-1412.2023.04.001

Expression and function of transforming growth

factor-β activated kinase 1 in osteoarthritis

CUI Daoran， JIN HU Richa， YANG Jian， CUI Zhiming

（Department of Orthopedics， Second Affiliated Hospital of Nantong University/the First Hospital of Nantong， Jiangsu 226001）

[Abstract]   Objective：To investigate the expression and role of transforming growth factor-β activated kinase 1 （TAK1） in osteoarthritis. Methods：Twenty knee joint samples from patients undergoing total knee arthroplasty or amputation were collected and divided into the normal group （8 cases） and the degenerative group （12 cases）. Pathological examination and OARSI score were performed under microscope. The expression of TAK1 in chondrocytes was detected by immunohistochemistry. A TNF-α （20 ng/mL） -induced chondrocyte apoptosis model was established， and the apoptosis of chondrocytes was detected by TUNEL. The expression levels of TAK1 and activated Caspase-3 at different time points after TNF-α treatment were detected by Western Blot. Immunofluorescence staining was used to detect the localization of TAK1 and activated Caspase-3 in chondrocytes. The effect of inhibiting the expression of TAK1 by siRNA on the expression of activated Caspase-3 was observed. Results： The sections of surgical specimens showed that there were deep cracks on the cartilage surface in the degenerative group， the cell volume was reduced， and a large number of chondrocytes were necrotic. The OARSI score of the degenerative group （3.50±1.00） was significantly higher than that of the normal group （0.50±0.54）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Immunohistochemistry showed that the percentage of TAK1 positive cells in the degenerative group （77.28%） was significantly higher than that in the normal group（15.35%）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Western Blot showed that TAK1 expression was low at 0 hour after TNF-α induction， increased at 12 hours after induction， and reached the peak at 36 hours （P<0.05）. The expression of activated Caspase-3 was upregulated at 12 h and peaked at 24 h. The number of TUNEL positive cells increased significantly after TNF-α induction （P<0.05）. Immunofluorescence staining showed that TAK1 and activated Caspase-3 were co-localized in chondrocytes induced by TNF-α. The expression of activated Caspase-3 increased after silencing TAK1 by siRNA transfection （P<0.05）. Conclusion：The expression of TAK1 is up-regulated in osteoarthritis， which may play a role in inhibiting chondrocyte apoptosis by inhibiting the expression of Caspase-3. TAK1 plays an important role in the progression of osteoarthritis.

[Key words]   transforming growth factor-beta activated kinase 1 （TAK1）; Caspase-3; osteoarthritis; chondrocyte; apoptosis

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是人类关节最常见的退行性疾病，表现为骨赘形成、软骨下骨增厚、软骨侵蚀和关节间隙狭窄[1]。有研究认为，OA为特异性免疫反应[2]，病理上具有细胞基质损伤和组织细胞丢失特点。在OA病理进展过程中，软骨细胞凋亡增多，促炎细胞因子产生增加以及基质退化[3-4]。促炎细胞因子的产生主要由异常激活的核因子-κB（NF-κB）途径和有丝分裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）途径介导[5]。转化生长因子β激活激酶1（transforming growth factor-beta activated kinase 1，TAK1）是MAPK激酶（MAP3K）家族成员，通过激活下游效应物（包括MAPKs和NF-κB）调节血管发育和激活细胞凋亡[6]。对基因工程小鼠的研究发现，TAK1在维持器官组织稳态方面起着不可或缺的作用[7]。另有研究发现，在一定条件下软骨中缺失TAK1小鼠表现出严重的软骨不典型增生和关节异常，表明TAK1在软骨形态的发生和维护中具有重要作用[8]。本研究收集我院2021年1月—7月行全膝关节置换或截肢术20例患者的膝关节手术标本，建立TNF-α诱导的软骨细胞凋亡模型，研究TAK1对凋亡相关蛋白Caspase-3的影响，探讨TAK1在OA进展中的作用。

1   材料与方法

1.1   材料和试剂   抗TAK1抗体（Abcam公司），抗cleaved-caspase-3抗体（Cell Signaling公司），抗GAPDH抗体（Sigma-Aldrich公司），Cy3-Goat anti-Mouse IgG、Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG（Proper Tech公司），免疫组化工作液试剂盒（中杉金桥公司），TNF-α（Pepro Tech公司）。

1.2   关节软骨组织切片H-E染色及OARSI关节软骨退变评分   全膝关节置换术及截肢患者20例，根据影像学评估膝关节标本退变程度，分为正常组8例和退变组12例。取膝关节手术组织标本切片，置于60 ℃恒温箱烘烤1 h，在二甲苯中浸泡15 min，更换二甲苯后再浸泡15 min，随后分别在无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中浸泡。苏木精染色，1%盐酸酒精分色，1%氨水返蓝，酒精伊红染色。于不同梯度乙醇中脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。由3位病理医生分别在光学显微镜下观察关节软骨组织结构和细胞形态，进行OARSI关节软骨退变评分[9]，取平均值。OARSI关节软骨退变评分标准见表1。

1.3   免疫组织化学染色   组织切片经烘烤、二甲苯及不同浓度乙醇中浸泡后，置于枸橼酸钠缓冲液中浸泡，然后沸水煮10 min。切片上滴加3%过氧化氢（试剂A）去除内源性过氧化物酶，37 ℃孵育10 min，PBS洗3次。滴加封闭液，室温孵育15 min；滴加一抗，室温下孵育1 h，PBS洗3次。滴加适量反应增强液（试剂B），室温孵育20 min，PBS洗3次；滴加增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（试剂C），室温孵育20 min，PBS洗3次。然后显色、脱水透明、封片，显微镜下摄片。

1.4   软骨细胞培养   永生化人软骨细胞SV40（上海生物化学与细胞生物学研究所）加入含10%胎牛血清的Leibovitzs L-15培养液中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养，每隔3～4天传代1次。取SV40细胞加以TNF-α诱导，建立软骨细胞凋亡模型，进行相关实验。

1.5   TUNEL染色检测细胞凋亡   在24孔板各孔内放置1片小圆玻片，按5×103个/mL密度将SV40细胞接种至板中，每孔100 μL。加入20 ng/mL TNF-α诱导36 h，另设对照组不予TNF-α处理。采用TUNEL染色检测细胞凋亡，固定：使用预冷PBS清洗各孔，加入现配制的4%甲醛500 μL，室温固定15 min。弃去甲醛，PBS清洗2次。破膜：各孔加入含0.3%TritonX-100的PBST 500 μL，室温静置5 min。弃去PBST，PBS清洗。平衡：各孔再次加入200 μL平衡缓冲液，室温平衡处理8 min。配制反应体系：在平衡处理细胞同时，冰上将核苷混合物和rTdT酶解冻，按照配比配制反应体系。染液配制及之后实验均需避光进行。反应：平衡结束弃平衡液，取出玻片，小心滴加所配反应体系51 μL，置于避光湿盒，37 ℃孵育1 h，使之发生加尾反应。封片：弃去反应体系，PBS清洗2遍，取洁净载玻片，滴加荧光染料4′，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）封片。显色：荧光显微镜拍摄，或将玻片避光保存于4 ℃待检，可放置1周左右，避免荧光淬灭。

1.6   Western Blot   TNF-α（20 ng/mL）诱导软骨细胞0、12、24、36和48 h，分别提取各组细胞蛋白样品50 μg，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜（Millipore公司）转膜，250 mA，120 min，然后放入5%封闭缓冲液中，室溫摇床封闭2 h。加入一抗，孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，电化学发光试剂发光、显影、定影，进行图像分析。

1.7   软骨细胞siRNA转染   按siRNA说明书配制转染混合试剂，依次向RNase-free管内加入Opti-MEM、siRNA以及siRNA转染用RNAiMAX，轻轻混匀后于室温静置15 min。使用预温的PBS清洗软骨细胞后消化，稀释细胞浓度为25～30万个/mL。转染混合试剂按说明书比例加入孔板中，每孔加入1 mL细胞悬液，混匀，置于细胞培养箱培养。为规避转染试剂毒性，16 h后将培养基换成含双抗的完全培养基。

1.8   统计学处理   应用GraphPad Prism 6、ImageJ和SPSS 17.0统计学软件分析数据。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析及t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2   结      果

2.1   关节软骨病理改变及OARSI评分   H-E染色切片显示，正常组关节软骨表面完整，软骨细胞排列有序，而退变组软骨表面出现较深裂隙，细胞体积缩小，大量软骨细胞坏死。退变组OARSI评分3.50±1.00分，高于正常组的0.50±0.54分，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2   退变关节软骨中TAK1表达   免疫组化结果显示，退变组软骨细胞TAK1阳性细胞百分率77.28%，高于正常组的15.35%，差异有统计学意义（P<0.05），提示TAK1表达可能影响软骨细胞生长发育，进而影响OA的发病。见图2。

2.3   TAK1与Caspase-3在软骨细胞凋亡模型中的表达及共定位   Western Blot检测显示，在TNF-α（20 ng/mL）诱导0 h TAK1表达低水平，诱导后12 h TAK1表达开始上调，36 h达到峰值，诱导后12 h、24 h、36 h、48 h TAK1表达水平高于0 h，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）（图3A、B）。活化Caspase-3表达在诱导12 h开始上调，24 h达到峰值，差异均有统计学意义（P<0.001）（图3C）。TUNEL检测发现，TNF-α诱导36 h后TUNEL阳性细胞数明显增加［0 h阳性细胞率（21.2±1.8）%、36 h的阳性细胞率（42±5.3）%］，差异有统计学意义（P<0.05）（图3D）。免疫荧光染色显示，TAK1和活化Caspase-3在TNF-α诱导的软骨细胞中共定位（图3E）。表明Caspase凋亡途径可能在OA进展中起重要作用，TAK1可能在调控软骨细胞凋亡过程中发挥影响。

2.4   siRNA转染抑制TAK1表达对Caspase-3表达的影响   为了进一步确定TAK1与软骨细胞凋亡的相关性，采用siRNA转染方法抑制TAK1表达。我们设计3种siRNA片段，并通过Western Blot确定siRNA片段3具有最佳敲除效率（图4A、B）。TAK1沉默后人软骨细胞凋亡模型中活化Caspase-3蛋白表达增加（图4C、D），差异有统计学意义（P<0.05），表明TAK1可能通过抑制Caspase-3的表达而发挥抑制软骨细胞凋亡的作用。

3   讨      论

骨关节炎为慢性关节退行性疾病[2]，目前尚无有效的保守治疗方法，进一步了解OA发病机理，发现潜在的治疗靶点十分必要。本研究免疫组织化学显示，退变组关节软骨细胞中TAK1表达明显增强。Western Blot检测结果显示，人软骨细胞经TNF-α处理后TAK1表达明显增加，凋亡蛋白Caspase-3表达也上调。免疫荧光显示，TAK1与活化Caspase-3共定位表达。siRNA沉默TAK1后，活化Caspase-3表达明显上调。上述结果说明TAK1可能在抑制OA软骨细胞凋亡过程中起着重要作用。

有證据表明，细胞因子、趋化因子、粘附分子和基质降解酶等炎症因子在OA发病中具有重要作用[10]。炎症因子表达主要受NF-κB和MAPK途径控制，过度机械压力刺激、细胞外基质降解产物和促炎性细胞因子的释放均会导致炎症因子表达增高[11]。TAK1可被多种信号分子激活，其中包括TNF-α和IL-1等细胞因子[12]。活化的TAK1激活MAPK，同时NF-kB和MAPK诱导炎性细胞因子和下游抗凋亡蛋白的表达，从而导致凋亡蛋白Caspase-3活化。

在无TAK1情况下，细胞对凋亡十分敏感。TAK1调节TNF-α诱导的细胞死亡，形成诱导死亡的信号复合物，包括TRADD、FAS相关蛋白和死亡结构域FADD，RIPK1和Caspase-8[13]。在这些复合物中，Caspase-8被二聚化，进行自我切割并被激活，可进一步激活下游执行者Caspase-3，从而导致细胞凋亡[14]。TAK1通常对TNF-α激活的Caspase-8/-3产生影响，抑制Caspase激活级联反应，以阻止细胞凋亡性死亡[15]。TAK1抑制Caspase激活有两条主要途径，其一是TAK1-NF-kB途径：TAK1是NF-kB通路上游的激酶[16]，NF-kB转录过程中会产生相应的细胞因子激活抗凋亡蛋白，如c-FLIP和IAP家族蛋白。IAP家族包括cIAP1、cIAP2和XIAP，它们抑制Caspase激活。c-FLIP结构与Caspases-8类似，但不具有蛋白酶活性，能与Caspase-8形成异二聚体，从而抑制高活性Caspase形成。TAK1通过激活NF-kB从而抑制Caspase激活。TAK1抑制Caspase激活的另一个途径是TAK1-ROS-cIAP途径：先前有研究表明，TNF家族配体诱导的外源性激活途径通常不依赖RIPK1，并且RIPK1激酶活性不是激活Caspase所必需的。只有当cIAP被合成的IAP拮抗剂发挥拮抗作用，开始代谢或具有遗传毒性时，TNF-α才可以诱导有代谢活性的RIPK1，促进Caspase-8激活。另外，有研究发现，抑制TAK1会降低TNF-α刺激后cIAP蛋白含量。TAK1缺乏会影响TNF-α刺激、积聚活性氧（ROS）及ROS清除剂，从而诱导ROS降解cIAP[17]。实际上，ROS清除剂可以修复TAK1缺陷细胞，因为在与去除TAK1相同的实验条件下，NF-kB的消耗仅会稍微增加ROS，所以TAK1-ROS-cIAP途径可能独立于TAK1-NF-kB途径。这些途径的激活以及细胞氧化还原系统的调节都是抑制细胞凋亡的关键。未来研究需要确定TAK1调节细胞氧化还原状态的分子途径。

综上所述，TAK1在骨性关节炎中表达上调，可能通过抑制Caspase-3的表达而发挥抑制软骨细胞凋亡的作用，在骨性关节炎进展过程中具有重要意义。

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[收稿日期] 2022-09-20

（本文編辑   缪宏建）