DACT3在卵巢癌中的表达及其意义

徐慧　王璇　韩勇　石宇

[摘   要]   目的：探究β-環连蛋白抑制基因3（dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3，DACT3）在卵巢癌中的表达及其预后意义。方法：从TCGA及GTEx数据库中收集卵巢癌组织基因测序数据，分析DACT3表达与卵巢癌患者总生存期（overall survival，OS）及无进展生存期（progression-free survival，PFS）的相关性。选择60例手术切除的浆液性卵巢癌及正常卵巢组织标本，采用免疫组化检测组织中DACT3表达，分析DACT3表达与患者临床病理特征及OS的相关性，采用单因素和多因素COX回归分析影响卵巢癌预后的危险因素。采用细胞划痕实验观察siRNA转染对人卵巢癌腺癌细胞株SKOV3迁移能力的影响。结果：TCGA及GTEx数据库数据显示，DACT3高表达患者的OS和PFS较短（P<0.05），COX回归分析显示，DACT3表达是影响卵巢癌预后的独立危险因素（P=0.00051）。对60例临床卵巢癌患者分析显示，DACT3表达与肿瘤分化程度及FIGO分期相关（P<0.05），DACT3高表达患者OS较短。免疫组化显示，卵巢癌组织中DACT3高表达，高级别卵巢癌组织中DACT3表达较低级别更强。干扰DACT3表达后SKOV3细胞迁移能力显著减弱。结论：DACT3在卵巢癌中高表达，是影响卵巢癌预后的独立危险因素，有可能作为卵巢癌患者的预后指标和分子治疗的靶标。

[关键词]   β-环连蛋白抑制基因3；卵巢癌；预后

[中图分类号]   R737.31 [文献标志码]   A [DOI]   10.19767/j.cnki.32-1412.2023.04.003

Expression and significance of DACT3 in ovarian cancer

XU Hui1，2， WANG Xuan2， HAN Yong3，4， SHI Yu3

（1Department of Obsetetrics and Gynecology， Huaian Second Peoples Hospital， Jiangsu 223002; 2Medical College of Nantong University; 3Department of Radiation Oncology， Affiliated Hospital of Nantong University;

4Cancer Center of the First Peoples Hospital affiliated to the Shanghai Jiao Tong University）

[Abstract]   Objective： To investigate the expression and prognostic significance of dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3（DACT3） in ovarian cancer. Methods： Ovarian cancer tissue and normal tissue sequencing data were downloaded from the Cancer Genome Atlas （TCGA） and GTEx databases to analyze the correlation of DACT3 with overall survival （OS） and progression-free survival （PFS） in patients with ovarian cancer. Sixty cases of serous ovarian cancer and normal ovarian tissue were selected. Immunohistochemistry was performed to detect DACT3 expression in ovarian cancer tissues. Univariate and multifactorial COX analyses were performed to test the risk factor affecting the prognosis of ovarian cancer. Cell migration ability of SKOV3 was detected by cell scratch assay. Results： TCGA and GTEx database data displayed that OS and PFS were shorter in patients with high DACT3 expression （P<0.05）; COX analyses suggested that DACT3 could be an independent prognostic predictor in ovarian cancer （P=0.00051）. Analysis of 60 ovarian cancer patients showed that DACT3 expression was correlated with tumor differentiation and FIGO stage （P<0.05）， and patients with high DACT3 expression had shorter OS. DACT3 was highly expressed in ovarian plasmacytoma， especially in high-grade types. Inhibition of DACT3 expression significantly inhibited cell migration. Conclusion： DACT3 is highly expressed in ovarian cancer， and is an independent risk factor affecting the prognosis of ovarian cancer. It may be used as a prognostic indicator and molecular therapeutic traget for ovarian cancer patients.

[Key words]   dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3; ovarian cancer; prognosis

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，致死率高。2020年全球180多个国家卵巢癌患者31.4万，死亡病例高达20.7万[1]。卵巢癌早期缺乏特异症状而不易发现，晚期则无有效的治疗方法，预后差，5年生存率仅20%～30%[2]。因此，寻找更多的分子靶点，研究候选基因在卵巢癌中的机制具有重要意义。β-环连蛋白抑制基因3（dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3，DACT3）既是上皮性卵巢癌中果蝇zeste基因增强子的人类同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）靶基因之一，又是Wnt通路重要调节分子，在肿瘤组织中起促癌作用[3]。本研究从TCGA数据库中下载卵巢癌有关数据，收集60例浆液性卵巢癌患者临床病理学资料及随访数据，采用SKOV3细胞转染后进行迁移能力实验，探究DACT3在卵巢癌中的的表达及其预后意义。

1   资料与方法

1.1   生信数据收集   从TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）及GTEx数据库（https：//www.gtexportal.org/home/）收集376例卵巢癌组织及180例正常组织基因表达谱数据，筛选阈值： logFoldChange>1.5且P<0.01。RNA-seq数据使用R语言进行归一化处理。

1.2   临床资料   收集2016年1月—2017年12月南通大学附属医院60例手术切除的浆液性卵巢癌及其癌旁正常卵巢组织标本，年龄32～74岁，平均55±2.02岁；低级别33例，高级别27例；FIGO分期I～II期33例，III～IV期27例。本研究获我院医学伦理委员会批准同意。

1.3   免疫组化检测DACT3表达   将60例手术切除的浆液性卵巢癌及其癌旁正常卵巢组织标本连续切片，4 μm厚，免疫组化染色采用ElivisionTM Plus法。DACT3表达水平根据染色强度和范围综合评估。染色强度：未染色计0分，淡黄色计1分，浅棕色计2分，深褐色计3分。染色范围：阳性细胞占总细胞<10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。上述两项得分的乘积为最终分数，≥3分视为高表达，<3分为低表达。

1.4   细胞培养与转染   人卵巢癌腺癌细胞株SKOV3（ATCC细胞库）以DMEM高糖培养基（含10%FBS和1%青霉素-链霉素）于5%CO2、37 ℃下培养，当镜下细胞密度达到80%～90%时传代，传代后细胞密度达到70%时进行siRNA转染，采用Lipofectamine 2000试剂（美国Thermo Fisher）进行细胞转染。分为DACT3干扰组和阴性对照组。

1.5   Western blot实验   收集转染48 h的SKOV3细胞，用RIPA裂解液提取蛋白。经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭。加入一抗稀释液（DACT3稀释比例1 ∶ 250，GAPDH稀释比例1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，加二抗稀释液（1 ∶ 3 000）室温孵育1 h，TBST洗膜后，使用ECL化学发光检测试剂盒进行信号检测。DACT3购自Bio-Techne，GAPDH及二抗购自碧云天生物技术有限公司。

1.6   细胞划痕实验   收集已转染的SKOV3细胞分别接种在6孔板上，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞密度达到90%以上时，采用无菌枪头在培养皿中均匀划痕，PBS洗涤3次，加入无血清培养基继续培养。在划痕0 h和24 h后显微镜下拍照，通过Image J圖像处理软件计算划痕愈合率。

1.7   统计学处理   应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计数资料以频数和率表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法分析患者生存期；单因素及多因素COX比例风险回归模型分析DACT3与卵巢癌预后的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2   结      果

2.1   DACT3基因与卵巢癌预后相关   基于TCGA数据库卵巢癌组织基因表达及生存数据分析，有40个基因在卵巢癌组织中差异表达，并与预后相关（图1A），DACT3表达与卵巢癌患者总生存期（overall survival，OS）及无进展生存期（progression free survival，PFS）呈负相关（P<0.05）（图1B）。

2.2   DACT3表达是卵巢癌预后的独立危险因素  单因素COX回归分析显示，除分期、分级外，DACT3表达、年龄、种族因素与卵巢癌预后相关，具有统计学意义（P<0.05），病理学分期、分级与卵巢癌预后无关（P>0.05）。多因素COX回归分析显示，DACT3表达是影响卵巢癌预后的独立危险因素（P=0.00051）（图2）。

2.3   DACT3在卵巢癌组织中高表达   免疫组化检测显示，正常卵巢组织不表达DACT3，卵巢癌组织表达DACT3，高级别卵巢癌组织中DACT3表达较低级别卵巢癌更强。DACT3在癌细胞核浆中均有表达，核内表达强于胞浆（图3）。

2.4   DACT3表达与卵巢癌临床病理特征相关性分析   60例卵巢癌中DACT3表达与肿瘤分化程度及FIGO分期有关（P<0.05）（表1）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，DACT3表达与患者OS显著负相关（P=0.001，图4）。

2.5   DACT3对SKOV3细胞迁移能力的影响   Western blot验证细胞的转染效率，sh-DACT3组DACT3表达显著抑制（图5A）。细胞划痕实验显示，干扰DACT3表达后SKOV3细胞迁移能力显著减弱（P<0.001，图5B-C）。

3   讨      论

卵巢癌居妇科肿瘤死亡率首位[4]，发病机制目前并不十分明确，有研究表明产次、服用避孕药和结扎输卵管是卵巢癌的保护因素，年龄、乳腺癌病史及家族史是卵巢癌的危险因素，环境因素及生活方式对患病率无明显影响[5]。75%卵巢癌患者初次诊断时已处第三期或第四期，癌细胞已扩散至盆外，无法从单纯的手术中获益[6-7]。随着治疗方案的进步，目前卵巢癌5年生存率提升至47%左右，但增长幅度仅2%～4%[4，8]。因此，研究卵巢癌新的分子标志物用以诊断、判定预后和治疗靶点具有重要意义。

DACT3属于DACT家族，在多种肿瘤中表达失衡[9]。乳腺癌中乳腺丝氨酸酶抑制剂（mammary serine protease inhibitor，MASPIN）会引起DACT3的高表达；食管鳞状细胞癌中DACT3的下调促进细胞自噬和提高肿瘤的恶性程度；此外，DACT3表达还可能影响甲状腺乳头状癌、结直肠癌的恶性程度[10-12]。在卵巢癌中EZH2引起DACT3高表达，其机制还不十分明确[3]。

本研究从TCGA及GTEx数据库下载有关卵巢癌组织及正常组织基因测序及患者临床数据，发现DACT3高表达患者的OS和PFS较短（P<0.05）；单因素、多因素COX回归分析显示，DACT3表达可以作为影响卵巢癌预后的独立危险因素（P=0.00051）。对60例临床卵巢癌患者病理特征及随访资料进行分析，发现DACT3表达与FIGO分期及肿瘤分化程度相关，DACT3高表达患者预后差，OS较短。免疫组化检测显示，正常卵巢组织中DACT3不表达，卵巢癌组织中DACT3高表达，高级别卵巢癌组织中DACT3表达较低级别卵巢癌更强，提示DACT3可能具有促进肿瘤恶性程度的潜力。细胞划痕实验显示，干扰DACT3表达后人卵巢癌腺癌细胞株SKOV3迁移能力显著减弱，提示DACT3可能与卵巢癌的侵袭、转移有一定关系。

综上所述，DACT3在卵巢癌中高表达，是影响卵巢癌预后的独立危险因素，有可能作为卵巢癌患者的预后指标和分子治疗的靶标。

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[收稿日期] 2023-04-07

（本文編辑   王晓蕴）